《分子生物学检验技术》实验指导【实验目的】把握动物组织DNA提取的方法；把握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。

【实验原理】获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。

因此，DNA样品质量的好坏将直截了当关系到实验的成败。

较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。

DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。

本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为操纵组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去兴奋该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K可水解蛋白质，消化D NA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。

260nm处DNA有最大吸取峰，测DNA的A260，可运算其浓度。

而蛋白质在280nm处有最大吸取峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。

【实验器材和试剂】1、动物小白鼠2、设备移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。

3、试剂（1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K （7）生理盐水，4℃贮存（8）无水乙醇、70%乙醇【操作步骤】1、制备肝匀浆迅速处死小白鼠，称取新奇肝脏组织50 mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 μl Buffer CL。

将肝匀浆液放入EP管，加入1.5 μl蛋白酶K，漩涡震荡10 s，55℃孵育直到组织溶解（约1小时）。

2、提取DNA（1）加入1.5 μl RNase A，颠倒混匀，37℃孵育15-60 min。

（2）冰上孵育1分钟使样品迅速冷却。

（3）加入1/3体积的Buffer PP，涡旋震荡20 s，12000 rpm离心3 min。

（4）将上清转移到—个新的离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，可见絮状沉淀（纤维状DNA）从溶液中析出。

12000 rpm离心1 min，弃上清。

（5）加入300 μl 70％乙醇，颠倒数次以洗涤DNA沉淀。

12 000 rpm离心1 min，弃上清，室温干燥15 min。

（6）加入50 μl Buffer GE溶解DNA（如果DNA的量比较大，能够65℃孵育以促进DNA的溶解），室温储存待测。

3、DNA浓度和纯度的测定取0.1 ml DNA样品，加蒸馏水至1 ml，在751紫外分光光度计上测A260值和A280值。

运算：DNA浓度（μg/ml）= A260×50×10 （请咨询系数50、10是如何得来的？）DNA纯度= A260nm/A280nm【注意事项】（1）由于DNA要紧存在于细胞核内，为便于提取DNA，肝脏的破裂要严格操纵好。

即要尽可能的将细胞膜破裂，又要尽可能多保留完整的细胞核，以保留60～70％的完整细胞核为宜。

为幸免D NA过度断裂，不宜用电动研磨器制备匀浆。

在提取过程中，染色体会发生气械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温顺的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。

（2）用氯仿除去组织蛋白，要持续振荡使蛋白质变性。

如要得到高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。

（3）酚和氯仿均有专门强的腐蚀性，操作时应幸免接触皮肤。

（4）室温下干燥时尽可能使残留的乙醇挥发掉（DNA中残留的乙醇会阻碍内切酶的活性或电泳时DNA不下沉），但不要让DNA 完全干燥，否则极难溶解，DNA溶解过程通常需要12-24hr。

（5）提取过程应尽量保持低温。

（6）在波长260nm紫外线下，1OD的光密度值相当于双链DN A浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡核苷酸为20μg/ml。

据此来运算核酸样品的浓度。

紫外分光光度法只用于测定浓度>0.25μg/ml的核酸溶液。

（7）A260nm/A280nm比值应介于1.8~2.0之间，若比值>2表示DNA样品中含有较多的RNA，如比值<1.8表明样品中有蛋白质污染。

应按照后续实验要求，采取不同的方法纯化。

因此也会显现D NA溶液中既含蛋白质又含RNA，其比值介于1.8~2.0的情形，因此有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。

【结果】1、A260 = ，A280 = 。

2、小鼠肝组织中DNA浓度是μg/ml。

3、小鼠肝组织中DNA的A260nm/A280nm比值是。

【摸索题】提取和纯化的真核组织DNA有何用途？你的A260nm/A280nm比值结果是否介于1.8~2.0之间？有何意义？请结合你的实验结果和操作步骤，分析如何检测和保证DNA的质量？实验二聚合酶链反应【实验目的】采纳聚合酶链式反应技术扩增小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白（SM22α）基因【实验原理】聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）用于体外扩增位于两段已知序列之间的DNA区段（靶序列）。

其原理是通过耐热DNA聚合酶催化的DNA合成反应达到对靶序列的扩增。

反应中使用两条化学合成的寡核苷酸作为引物，分不与模板DNA两条单链互补，待扩增序列片段位于两条引物之咨询。

PCR扩增包括3个步骤，即变性、退火和延伸。

反应需要模板、引物、DNA聚合酶和脱氧核糖三磷酸(dNTP)等的参与。

反应混合液被加热以使模板DNA 双链变性成为二条单链，随后将反应混合液冷却至引物的熔点温度(Tm)以下，使引物能与靶序列形成杂交双链（退火）。

当温度升至7 2℃左右时，反应体系中的DNA聚合酶按照模板链的序列以碱基互补方式依次把dNTP加至引物的3’端，使互补链从5 ‘向3’方向持续延伸，直至形成新的DNA双链。

通过变性、退火和延伸的一个循环能够使靶序列的分子拷贝数增加一倍。

由于每次扩增的产物又作为下一次扩增的模板，因此反应产物的量以指数形式增长，一个分子的模板通过n个循环可得2n个分子拷贝产物。

本实验扩增的是小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白（SM22α）基因，扩增产物片段大小为541bp。

扩增所用的上游引物序列为：5’-AGT TATATTAATTTTGCATAGTGCCTGGTTG-3’，下游引物序列为：5’-GCGCTAGCTACAAGGCTTGGTCGTTTG-3’。

【实验器材和试剂】1、设备PCR仪、0.2ml PCR反应管、1.5ml离心管、移液器、吸嘴、旋涡混合器。

2、试剂（20 μl体系）PCR试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）【操作步骤】分不在PCR反应管中加入2×PCR mix 10 μl、上游和下游引物各2 μl、DNA 2 μl和H2O 4 μl。

把PCR反应管放人PCR仪，按仪器操作要求启动扩增程序。

本实验的扩增程序为：94℃预变性5分钟后进入循环扩增，即94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1 min。

重复35个循环后，于72℃再延伸10 min，最后4℃保温。

反应终止后，将PCR反应管于12000 rpm离心15s，取扩增产物进行电泳分析。

【注意事项】1、由于PCR技术的灵敏度高，极微量的污染也会造成扩增的假阳性结果。

因此，必须采取相应措施幸免发生污染。

2、PCR实验应当设置阴性对比反应，即在反应体系中不加模板DNA。

3、多份样品同时扩增时，可配制总的反应混合液，并分装于P CR管中，然后再在各管中分不加入模板。

4、临床诊断用PCR反应必须在专门的PCR实验室中进行，实验室应包括试剂配制室、模板制备室、PCR扩增室和产物检测室等功能区。

PCR实验中的各个步骤应在相应的功能区中进行。

5、PCR试剂与模板DNA及样品应分不储存于不同功能区的冰箱中。

6、操作时应戴手套，配制反应体系和加模板时应分不使用专用的移液器，所有耗材使用前必须经高压灭菌，用后按规定处理并丢弃在指定容器中。

【结果】【摸索题】PCR各组分在反应中的作用是什么？降低退火温度、延长变性时刻会对反应有何阻碍？实验三琼脂糖凝胶电泳【实验目的】把握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。

【实验原理】带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。

电泳的种类多，应用专门广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。

琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用技术。

DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

D NA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。

具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。

凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA ，也能够分离相对分子质量相同，及构型不同的DNA 分子。

琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，一般琼脂糖凝胶分离DNA的范畴为0.2-20kb，其辨论率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范畴广。

荧光染料溴化乙锭(EB)能插入DNA分子中形成复合物，紫外光照耀下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量。

由于E B是致癌剂，现在开发出了安全的染料，如Syber Green、GelRed、GoldView等。

【仪器与试剂】1. 仪器天平、锥形瓶、微波炉（或电炉）、制胶板、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像分析仪（或紫外线透射仪）、微量可调移液器、移液管、量筒、一次性塑料手套。

2. 试剂（1）50×TAE电泳缓冲液：Tris碱242.0g、冰乙酸57.1 ml、E DTA 63.5g、NaOH 10.0g，加蒸馏水至1000 ml，使用前用蒸馏水稀释至1×TAE电泳缓冲液。

（2）6×loading buffer ：( 0.25％溴酚蓝，0.25%二甲苯氰FF，30%甘油水溶液)或（0.25％溴酚蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液），贮存于4℃。

（3）电泳级琼脂糖（Agarose）、溴化乙锭（母液: 将EB 配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可）、DNA Marke r、DNA、蒸馏水。