罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书
注意：Label溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴，严禁吸入和食入。

反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中，按有毒废物处理。

特异性：TUNEL反应优先标记凋亡产生的DNA链断裂，从而辨别凋亡与坏死、以及由抑制细胞生长的药物或放射线产生的primary DNA链断裂
实验干扰：假阴性：在某些型式的凋亡细胞中DNA链断裂可能缺失或不完全。

空间位阻，如细胞外元件可能阻止TdT到达DNA断裂处。

两种情况均能产生假阴性。

假阳性：在坏死晚期，可能产生大量的DNA片段
DNA链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出现。

两种情况均能产生假阳性。

为确认细胞死亡的凋亡型式，应认真进行每种细胞的形态学检查
凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式，因此，对于可以结果进行解释时，
细胞形态评估是一项重要的参数
样本：细胞离心涂片和细胞涂片
在chamber slides上培养的黏附细胞
冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本
分析时间：2-3小时，除外培养、固定和渗透
检测次数：一个试剂盒50T
1 流程图：
2 样品准备
2.1 黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片
需准备的其他试剂：Washing buffer：磷酸盐缓冲液（PBS）
Blocking buffer封闭溶液：甲醇稀释的3% H2O2
Fixation solution固定溶液：PBS配制的4%多聚甲醛，ph 7.4，新鲜配制
Permeabilisation solution 渗透液：0.1%Triton1）X-100溶于0.1%柠檬酸钠溶液中，新鲜配制
步骤：下表描述了细胞固定、内源性过氧化物酶封闭和细胞渗透过程。

2.2.1 福尔马林-包埋组织
福尔马林包埋组织的预处理：可按4种不同的方式预处理。

如用蛋白酶K，不含核酸酶，
浓度、孵育时间和温度应按组织类型优化
注意：只用罗氏应用科学的蛋白酶K，因其经检测不含核酸
酶，核酸酶可导致假阳性。

另外3中替代方法在下表中描述（step 2）
需准备的其他试剂：二甲苯和乙醇（浓度：95%，90%，80%，70%，溶于双蒸水中）
Washing buffer：PBS
蛋白酶K，不含核酸酶，工作浓度：[10-20ug/ml，溶于10mM Tris/HCL
中，ph7.4-8]
替代处理方案
※渗透溶液：0.1%Triton1）X-100，溶于0.1%柠檬酸钠的，新鲜配制
※胃蛋白酶*（0.25%-0.5%，溶于盐酸中，ph2）或胰蛋白酶*，0.01N HCL，
不含核酸酶
※0.1M柠檬酸缓冲液，ph6，微波照射
步骤：下表描述了用蛋白酶K（不含核酸酶）和3中替代方法预处理福尔马林-包埋组织的方法
3 标记草案
3.1 开始之前
准备TUNEL反应混合液：每一对管子（小瓶1：酶溶液，小瓶2：标记溶液）足以用于50ul
反应体系的10张片子，和2个50ul标记溶液的阴性对照。

注意：TUNEL反应混合液应于用前临时配制，不能储存。

TUNEL
DNase I，重组，级别1*
需准备的其他设备和试剂：Washing buffer：PBS
湿盒
Parafilm石蜡封口膜或盖片
3.4 信号转换
需要准备的其他设备和试剂：Washing buffer：PBS
湿盒
Parafilm石蜡封口膜或盖片
DABA底物或POD替代底物
光镜镜检封固剂。