生物化学实验实验基本原理1 有效数字计算（结合电子天平的应用等）加减法：进行数字加减时，最后结果所保留的小数点后的位数应与参与运算的各数中小数点后位数最少者相同，其尾数“四舍五入”。

如：0.124+1.2345+12.34=13.6979，应取13.70。

乘除法：进行数字乘除时，最后结果的有效数字应与参与运算的各数中有效数字位数最少者为准，而与小数点的位数无关，其尾数“四舍五入”。

如：1.23×0.12=0.1476,应取0.15。

2 误差分析误差为实验分析的测定值与真实值之间的差值。

误差越小，测定值越准确，即准确度越高。

误差可用绝对误差和相对误差表示。

绝对误差= 测定值- 真实值相对误差= 绝对误差÷真实值×100%一般用相对误差表示结果的准确度，但因真实值是并不知道的，因此实际工作中无法求出分析的准确度，只得用精确度来评价分析的结果。

3 偏差分析（结合“可溶性蛋白或赖氨酸实验”要求掌握）精确度表示在相同条件下，进行多次实验的测定值相近的程度。

一般用偏差来衡量分析结果的精确度。

偏差也有绝对偏差和相对偏差两种表示方法。

绝对偏差= 单次测定值- 算术平均值（不计正负号）相对偏差= 绝对偏差÷算术平均值×100%例如：分析某一材料糖含量，共重复测定5次，其结果分别为：16.1%，15.8%，16.3%，16.2%，15.6%，用来表示精确度的偏差可计算如下：分析结果算术平均值个别测定的绝对偏差（不计正负）16.1% 0.1%15.8% 0.2%16.3% 16.0% 0.3%16.2% 0.2%15.6% 0.4%平均绝对偏差=（0.1%+0.2%+0.3%+0.2%+0.4%）÷5 = 0.2%平均相对偏差= 0.2÷16.0×100% = 1.25%在实验中，有时只做两次平行测定，这时就应用下式表达结果的精确度：两次分析结果的差值÷平均值×100%4 实验结果的表述：实验结果可用列表法（“影响酶作用的因素”常用）和作图法（综合实验用）表示。

第1章分光光度技术分光光度技术是光学（光谱）分析技术的一种，它是利用物质的特征吸收光谱来对不同物质进行定性和定量分析的一项技术。

我们将重点介绍紫外光-可见光分光光度法。

一、紫外光-可见光分光光度法的基本原理1、讨论的波长范围：200～400nm的紫外光区和400～760nm的可见光区。

人肉眼可见的光线称可见光，波长范围在400～760nm；200～400m为紫外光区，760～400000nm为红外光区。

2、发射光谱与吸收光谱：发射光谱：不同光源发射光谱不同。

对电灯来说，钨灯发射可见光源，氢灯发射紫外光源。

吸收光谱：被溶液吸收后的光谱。

（在分光镜上呈现暗带的光谱）。

当一束单色光通过溶液时，一部分被溶液吸收，一部分光可反射、折射、吸收、透过，溶液的厚度愈大，光过越少。

3、吸收光谱中的透光度（T）与吸光度（A）：吸收光谱类仪器的检测读数盘上都有两种数字，T或A（或 E 消光度）（1）透光度（T ）：表示透过的光占入射光的比例（%表示）当一束光通过一杯样品溶液时，射光 = 反射光 + 折射光 + 吸收光 + 透过光当用空白（组成该样品溶液的溶剂）校正后，入射光 = 吸收光 + 透过光透光度(T）=样品透过光强度/空白透过光强度此时空白透过光强度是样品真正入射光强度。

（2）吸光度（A）：是物质所吸收的光的一种度量，数值上等于透光度的倒数的对数（透光度的负对数），即 A = -lgT（3）朗伯-比尔定律：A = K C L，吸光度与溶液浓度（C）和液层厚度（L）成正比。

（K 为常数，同种物质K 相同，不同物质K 不同）如固定L（比色皿厚度），A 只与C 成正比。

朗伯-比尔定律使用条件：待测液是均匀稳定的稀溶液；入射光是严格的单色光。

4、分光光度法（比色法，P23）：（1）定义：利用分光光度计产生的单色光照射待测溶液，通过检测吸光度，对溶液中存在的具有光吸收能力的物质进行定性或定量分析的方法。

（2）测定方式：用已知标准浓度和未知浓度的待测液进行比色分析，根据两者间的吸光度做比较求得待测液的浓度。

还需设置“空白”，以消除光的反射和折射。

(3)光源：通过钨灯或氢灯产生可见光或紫外光。

二、分光光度法的测量方法1、标准曲线法：配制一系列不同浓度（C）的标准溶液，以纯溶剂为空白，测定标准溶液的A值，以A值为纵坐标，C为横坐标绘制标准曲线。

2、回归方程法：得到的标准曲线数据可通过一元线性回归求出标准曲线方程。

（见P27附。

具体应用，先确定x和y，再按公式计算）。

3、仪器直读浓度法：7200等分光光度计可直接读出浓度。

只需配出一个C标，校正仪器至已知浓度，将待测液推入光路，旋钮拨至C档，即可直接读出浓度。

4、列解联立方程法:对于多组分和二组分混合液可选择多个或两个波长（一般为各组分的最大吸收波长）分别测出吸光度（A），再按方程组计算。

（P124，实验29属于此类）三、分光光度法的应用（见P26）参考原则：•有紫外吸收的可选用紫外分光光度计测定，如蛋白质、核酸、生物碱、硝酸盐等•无色的物质可通过显色用可见分光光度计测定，如蛋白质、氨基酸、核酸、酶、糖类等•有色的物质可直接用可见分光光度计测定，如色素。

四、紫外-可见分光光度法测定物质浓度的一般操作（P27）1、配制标准溶液，制标准曲线2、样品准备和提取：称样→浸提（加热或研磨）→稀释至一定浓度→显色（紫外不必）3、测定：选择适当波长→选择适当比色皿→倒入待测液→调节仪器→读数→记录4、计算：根据公式，带入各数据计算结果。

思考题（1）分光光度法的基本原理如何？应用在哪些方面？（2）结合实验，总结分光光度法测定物质含量的一般操作过程和注意事项。

（3）简述分光光度计的组成及使用方法。

（4）名词：透光率，吸光度，吸收光谱，标准曲线第2章离心技术1、概念：1）离心：是利用离心机产生离心力来分离具有不同沉降系数的物质的方法。

2）离心技术（centrifugal method）是利用离心机旋转运动产生的离心力，将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，而达到分离、浓缩或提纯等目的的一门技术。

应用：在生物科学，尤其是在生物化学和分子生物学方面的应用已经十分广泛。

2、基本原理：物质颗粒在离心过程中受到的作用力主要有离心力、介质阻力和介质浮力等。

1）离心力（F）：定义：物质颗粒在离心场中受到一个远离旋转轴的力即为离心力。

表示：常用地球引力的倍数表示，“数字×g”（g为重力常数）。

例如25000×g，则表示相当于地球引力的25000倍（高速离心）。

实际应用中，特别是低速离心，常用每分钟转数v 表示（r·min-1或rpm）。

2）浮力密度：物质的质量减去在一定介质中所受的浮力即为浮力密度。

只有物体的密度大于介质密度的情况下，该物体才会发生沉降。

3）沉降阻力：物体在介质中沉降时，所受到的介质阻力。

沉降阻力取决于介质的粘度。

4）沉降速度：即单位时间内物质颗粒移动的距离。

它与物体的密度成正比，与介质的摩擦系数（粘度）成反比。

3、离心机的分类（P10）可从转速、用途、离心形式、转子形式、使用温度等方面对离心机进行分类。

根据离心机转速不同，可分为三类：低速（普通）、高速和超速离心机。

(1)普通离心机：转速在8000 rpm或6000×g以下，一般性制备用（一般实验中用）。

(2)高速离心机：转速可达25000 rpm或89000×g，需要带有冷却离心腔的制冷设备，以控制转子高速旋转产生的磨擦热。

(3)超速离心机：转速在30000 rpm以上，可产生高达500,000×g的离心力；可使亚细胞器、病毒分级分离，也可用于测定蛋白质、核酸的相对分子量等。

由于转速极高，因此它除带有制冷设备外，还具备真空系统。

4、常用离心技术1）差速离心法：基于待测物质颗粒的大小、密度不相同，其沉降速度不一样而得到分离。

2）速率区带离心（沉降速度超速离心）：样品中粒子（大分子）因大小和沉降速度不同，在梯度介质中呈分离的区带状沉降，（管中形成区带）。

同样的粒子处于同一区带（图1-1-4 ）首先在离心管中灌装好预制的一种密度梯度介质液，在其上面小心铺上一层样品溶液（图1-1-4 ），离心期间，样品中各组分会按照各自的沉降速率沉降，被分离成一系列的样品组分区带，故称率区带离心。

3）等密度梯度离心（沉降平衡超速离心）：样品中粒子（大分子）因浮力密度不同，粒子移至它本身相同密度的地方形成区带（管中形成区带）（图1-1-5）。

如果离心管中介质中的密度范围包括待分离样品中所有组分的密度，离心过程中，各组分将逐渐移至与它本身密度相同的地方形成区带。

速率区带法和等密度梯度法的区别：●开始介质有无梯度（前者有，后者无但在离心中自动生成）；●介质不同（前者可用蔗糖、甘油等，后者常用碱金属的盐溶液）。

5、离心技术的应用1）物质的分离：将固体与液体分离，或将互不相溶的液体分开。

2）测定沉降系数和分子量：超速离心6、离心操作的一般过程1）仪器选择：根据需要选择2）离心准备：样品装入离心管，做好标记并进行平衡。

再按对称方向放到离心机中。

3）离心：关闭离心腔盖，调整旋钮或按钮至设定时间及转速（低速离心机逐渐增速）开始离心。

4）检测、分离已离心样品：取出离心管，用长吸管、移液器、注射针头等工具吸取所需的液体分离层，或直接倾去液体层，留下所需的固体层。

思考题（1）何为离心技术？它有什么用处？（2） 简述离心机的分类。

（3） 结合实验，说明普通离心操作应注意哪些问题。

（4） 名词：离心力，沉降系数，沉降速度，差速离心，等密度梯度离心第3章 层析技术定义：层析技术（层析法）是根据物质的理化性质而建立的分离、分析物质的方法。

（P15）⏹ 发现历史：层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家将植物叶片提取的色素通过装填有CaCO3的柱子，各种色素以不同速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。

⏹ 层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。

层析法是生物化学中常用的分离分析技术之一。

一、 层析法的基本原理层析法是利用混合物中各组分物理、化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（固定相和流动相）中发生相互作用（吸附、溶解、结合等）使各组分以不同速度移动而达到分离的目的。

1、 分配系数（K ）：通常被用来描述一种化合物在互不相溶的两个相中的分配状况。

溶质在移动相中的浓度溶质在固定相中的浓度K2、 分离原理（P15）（见图1-2-1 ）3、 层析法分类1）按层析过程的机理（依据的理化性质）分类2）按两相的物态（固、液、气）分类3）按操作形式（支持物、装置等）分类（见P17,表1-2-1 层析法分类表)4、几种层析方法简介1） 分配层析（1）原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）中的分配系数不同，分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，移动慢。