单杂交系统，one hybrid system DNA和蛋白质间相互作用。 鉴定与特定DNA序列直接作用的蛋白质。
三杂交系统，three hybrid system RNA或小分子配体和蛋白质的相互作用 三者共同作用，才能激活转录。
三、酵母双杂交技术在蛋白质组 学中的应用
Interactome 互作组：全面详尽的 蛋白质相互作用图谱。 病毒、细菌、酵母、线虫等。 T7噬菌体：首先用于大规模Y2H分析：
蛋白质相互作用控制着生命过程的各个方面
Yeast Two Hybrid Mass Spectrometry
二、酵母双杂交技术及进展
Yeast Two-Hybrid，Y2H.
Fields S. and Song O.: Nature, 1989, 340: 245-246
研究蛋白质相互作用的方法,利用转 录因子组件式（modular）结构的性 质。Y2H 就是将需要研究的蛋白质设 计成“诱饵”，以钓出能与诱饵蛋白 发生物理相互作用的蛋白质（被捕食 蛋白质）。
Yeast
Organism Technology Protein arrays Pools of prey Number of assays (bait×prey) 192 ×proteome proteome ×proteome Detected interaction s 281 692 Alread y known 109 S.cerevisiae (~6000ORFs)
10 ×proteome 22 fragments ×proteome
Random × Random
• McCraith S.,et al. Genome-wide analysis of vaccinia virus proteinprotein interactions. Proc.Natl. Acad.Sci. 97,4879-4884 (2000) • Flajolet M.,et al. A genomic approach of the hepatitis C virus generates a protein interaction map.Gene 242,369-379 (2000) • Bartel P.,et al.A protein linkage map of Escherichia coli bacteriophage T7. Nature Genetics 12,72-77(1996)
Technology
Protein array
Number of assays (bait×prey) proteome ×proteome
Detected Already interactions known 37 0 5 25 9 2 2 4
Protein array HCV(10ORFs) Library screening T7 Library screening
噬菌体展示技术（Phage display）
· · · ·
Ph.D.-7 Phage Display Peptide Library Kit Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library Kit Ph.D. Peptide Display Cloning System
其他新的双杂交系统： 分离的泛素系统 split-ubiquitin syatem. (PNAS, 1996,91:10340-10344) 利用泛素的功能特点。 当分别与泛素N端和C端部分融合的两 个蛋白质相互作用时，使分离的泛素的 两部分靠近，泛素专一性的蛋白酶就会 识别泛素，导致报道蛋白的解离释放。
430 assays of pools 96×96
3844 assays of pools 96×96 15×proteome 11 ×proteome 68×proteome
175
12
841 170 113 191
105 3 34 128
Viral genome
Organism
Vaccinia vrius (~266ORFs)





诱饵基因的扩增和表达载体的构建 诱饵表达载体转化到酵母库扩增,质粒提取 诱饵和猎物用共转化或交配(Mating)的方法转化 到同一酵母中 涂布到约50个筛选平板上 菌落长出后，挑取阳性菌落作beta-gal报道基因 实验 菌落PCR扩增猎物基因，测序 Blast分析得到猎物基因序列 阳性相互作用的重新验证(Co-IP,pull-down,共定 位等功能实验）
七、酵母双杂交技术方法
首先是选择适当的载体系统： BD, AD 载体：Gal4,LexA系统，多 已商业化。然后将待鉴不同结合型（a,α）的 表达“猎物”和“诱饵”蛋白的酵母菌 株一一结 未知蛋白。
Y2H开始以转录因子Gal4为基础，依靠 招募RNA聚合酶II激活转录。 1997：Marsoliter等建立以RNA聚合酶III 为基础的Y2H，假阳性率更低。
反向双杂交系统：reverse two-hybrid system. 构建反向筛选的报告基因（URA3， U合成所必需），蛋白质互作激活报告基因 表达，使细胞不能成活。
四、噬菌体展示技术 （Phage display）
噬菌体展示技术是利用噬菌体的外壳蛋白与目的 蛋白或多肽融合表达，将目的蛋白表达在噬菌体颗粒 的外部，在蛋白质水平上进行“Biopanning”体外筛 选，十分适用于酶与其配体或抑制剂、抗原决定簇、 细胞表面受体的筛选等等。这个筛选的过程很简单， 将目标肽或蛋白质固定于平板上，铺上噬菌体，噬菌 体外壳融合蛋白与目标肽结合，不能结合的噬菌体颗 粒将被洗掉，再将结合的噬菌体洗下，进行扩增培养， 再进行一到两次的轮回，就能够分离到特定的噬菌体 颗粒。
55个有25个相互作用。 丙型肝炎病毒HCV：编码10个成熟蛋白， 有5个相互作用。
酿酒酵母：6000多个ORF, 1996完成 基因组,P. et al., Nature, 2000,403:623-627.
线虫：148个相互作用： Walhout A.J. et al.: Science, 2000, 287: 116-122.
一个单转录因子有：
DBD: DNA binding domain DNA结合结构域。 AD:Activation domain, 转录激活结构域：能激活RNA聚合 酶起始转录。
诱饵蛋白B + DBD:不能起始转录
被捕食蛋白的ORF + AD:不能起始转录。
当诱饵蛋白和被捕食蛋白在同一细胞中 表达，如发生相互作用， RNA聚合酶将 启动报告基因His3转录，合成组氨酸， 如His3不表达，细胞不能生长。
Caenorhabditis elegans 线虫
Organism C.elegans(~ 20000ORFs) Technology Protein array Library screeing Number of assays (bait×prey) 29×29 27 ×proteome Detected interactions 8 124 Already known 6 3
八、双杂交系统及其应用
主要商业公司：

APPLIED BIOSYSTEMS BIOSIGNAL PACKARD INC.
CLONTECH
INVITROGEN ORIGENE TECHNOLOGIES INC.


PROMEGA CORP
QBIOGENE STRATAGENE
Clontech 公司的酵母双杂交系统
特点：
快速、安全，不需标记物和染料， 还可检测蛋白-核酸及其它分子间的相 互作用。 SPR DNA生物传感器可用于基因 突变的检测、PCR产物测定、病毒检 测等。
六、蛋白质间连锁图的建立
已建立酿酒酵母1548个蛋白质间 2358个相互作用网络: Fields, S. Lab: Nat. Biotechnology 2000,18:1257-1261.
Fields S. and Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 1989, 340: 245-246
优点：
酵母细胞几乎能表达所有生物基因。
缺点： 并非所有蛋白质能在酵母核内正常 行使功能，不正确的蛋白质折叠结构： 假阳性 假阴性
S.cerevisiae Pools of baits and prey (~6000ORFs) S.cerevisiae Pools of baits and prey (~6000ORFs) S.cerevisiae Library screening (~6000ORFs) S.cerevisiae Library screening (~6000ORFs) S.cerevisiae Library screening (~6000ORFs)
五、表面等离子体共振技术 SPR Surface Plasmon Resonance 研究蛋白质相互作用的新方法。如 瑞典BIACORE的单元蛋白质芯片。 将诱饵蛋白作为配基，固化在几十 纳迷厚的金属膜表面，加入含猎物蛋 白的溶液，如有相互作用会特异性结 合形成蛋白质复合物，使金属膜与溶 液界面的折射率上升，导致共振角度 改变。
分离杂交系统，split-hybrid system 利用2个相互整合的报告基因。
细胞质中的双杂交系统： SOS招募系统： SOS recruitment system 利用Ras信号传导途径的基本性质： 两种蛋白相互作用，就会将hSos (人的鸟苷酸交换因子)招募到膜上，激活 Ras,使酵母细胞在限制温度下成活和 增殖。