植物的组织培养技术【学习目标】1、指导植物组织培养技术的基本原理和基本技术。

2、掌握植物培养过程中使用的无菌技术（重点）。

3、掌握植物知识培养的基本过程及操作。

4、说出被子植物花粉发育的过程及花药例题培养产生花粉植株的两种途径。

5、说出花药离体培养的因素，学习话要例题培养的基本技术。

【要点梳理】要点一、植物组织培养的基础知识【高清课堂：植物的组织培养技术 高清未发布 课题1：基础知识】1、植物组织培养的基本过程：离体的植物器官、组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织。

愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。

由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化（去分化）。

脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫再分化。

再分化形成的试管苗移栽到地里，可以发育成完整的植物体。

植物组织培养的过程可以简要归纳为：离体的植物器官、组织或细胞（外植体）−−−→脱分化愈伤组织−−−→再分化根、芽—→植物体。

2、植物组织培养的理论基础：细胞的全能性要点诠释：细胞的全能性与植物组织培养间的关系①细胞的全能性是植物组织培养的理论基础。

植物组织培养的理论基础是细胞的全能性。

植物细胞只有脱离了植物体，在一定的外部因素作用下，经过细胞分裂形成愈伤组织，才能表现出全能性，由愈伤组织发育、分化出新的植物体。

②高度分化的植物细胞仍具有全能性的原因是所有体细胞均来自受精卵的有丝分裂，均有和受精卵相同的一整套遗传信息。

③植物体的组织、器官的形成，是基因选择性表达的结果，其细胞的全能性受到限制，在离体状态下，其全能性才容易得以表达，表达的过程须经过脱分化和再分化。

④容易进行营养繁殖的植物细胞，其全能性容易表达，易进行植物组织培养。

要点二、影响植物组织培养的因素1、无机营养（1）大量元素：除碳（C ）、氢（H ）、氧（O ）外，还有氮（N ）、磷（P ）、钾（K ）、钙（Ca ）、镁（Mg ）、硫（S ）等元素。

（2）微量元素：包括铁（Fe ）、铜（Cu ）、钼（Mo ）、锌（Zn ）、锰（Mn ）、钴（Co ）、硼（B ）和碘（I ）等。

2、有机营养（1）维生素类：植物组织培养中经常使用维生素C 、维生素B 1（盐酸硫胺素）、维生素B 6（盐酸吡哆醇）、维生素H （生物素）、叶酸和烟酸等，一般使用浓度为0.1～10 mol ／L 。

（2）氨基酸：有甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白（CH ）和水解乳蛋白（LH ）等，是重要的有机氮源。

（3）有机添加物：是一些成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等的复杂化合物，它们对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。

3、植物生长调节物质植物生长调节物质是培养基中的关键物质，对植物组织培养起着重要、明显的调节作用。

植物生长调节物质包括生长素、细胞分裂素及赤霉素等。

要点诠释：①植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。

在生长素存在的情况下，细使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但细胞不分化先使用细胞分裂素，后使用生长素细胞既分裂也分化同时使用分化频率提高②当同时使用这两类激素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向。

生长素的用量与细胞分裂素的用量比值低时，（即生长素少，细胞分裂素多）有利于芽的分化、抑制根的形成；比值高时，（即生长素多，细胞分裂素少）有利于根的分化、抑制芽的形成；比值适中时，促进愈伤组织生长。

可见，植物激素的浓度、使用的先后顺序以及用量的比例等，都会影响实验结果。

植物激素的应用要做到得心应手，还得靠大量实践。

4、能源和渗透压通常植物本身进行光合作用，产生糖类，不需要外部供给糖，但在植物组织培养进行异养的状况下，大多不能进行光合作用来合成糖类，因此必须在培养基中添加糖作为碳素来源和能量物质，同时糖对保持培养基的渗透压（一般需在1.5×105 Pa～4.1×105 Pa）也有重要作用。

5、温度温度是植物组织培养成功的重要条件（1）最适温度：在植物组织培养中大多采用最适温度，并保持恒温培养，以加速生长。

通常采用（25±2）℃的温度，对大多数植物来讲是合适的，但也因种类而异。

进行菊花组织培养，温度控制在18℃～22℃。

（2）温度预处理的影响：在植物组织培养以前先对培养材料进行低温或高温处理，往往有促进诱导生长的作用，为此，常在培养实践中采用。

6、光照组织培养中光照也是重要条件，它对生长和分化有很大影响。

当然这也与材料的性质、培养基情况以及由于光照而引起的温度上升等因素有关。

菊花培养的光照强度为1000 lx～4000 lx，每天照光12 h。

此外，进行菊花组织培养的pH控制在5.8左右。

要点三、植物组织培养的实验操作1、制备MS固体培养基MS培养基含有20多种营养成分，实验室一般使用4℃保存的配制好的培养基母液来制备。

具体操作如下。

（1）配制各种母液：配制母液时，无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存。

激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按l mg／mL的质量浓度单独配制成母液。

用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量。

（2）配制培养基：配制1 L MS培养基时，先将称好的琼脂加入800 mL蒸馏水，加热使琼脂熔化，然后加入蔗糖30 g，取配制好的大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏水定容至1000 mL，调节pH，最后分装到锥形瓶中，每瓶分装50 mL或100 mL。

由于菊花茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素。

（3）灭菌：将分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌。

2、外植体消毒（1）外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段，叫做外植体。

（2）外植体消毒：选取菊花茎段时，要取生长旺盛的嫩枝。

菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20 min左右。

用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70％的酒精中摇动2～3次，持续6 s～7 s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗。

取出后仍用无菌吸水纸吸干外植体表面水分，放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1 min～2 min。

取出后，在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液。

3、接种接种前用体积分数为70％的酒精将工作台擦拭一遍。

工作台消毒后，首先点燃酒精灯。

此后，所有的接种操作都必须在酒精灯旁进行，并且每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌。

将装有培养基的锥形瓶整齐地排列在酒精灯左侧。

将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段（长约0.5 cm～1 cm）。

左手持锥形瓶，右手拉开捆扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥于右手手心，以避免封口膜接触瓶口的一面被污染。

左手持瓶，使瓶口旋转通过火焰；右手用镊子夹取菊花茎段，插入培养基中。

插入时应注意方向，不要倒插。

每瓶接种6～8块外植体。

接种后，将封口膜重新扎好。

4、培养接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养期间应定期消毒。

培养温度控制在18℃～22℃，并且每日用日光灯光照12 h。

5、移栽在移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日。

然后用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间，等幼苗长壮后再移栽到土壤中。

6、栽培将幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。

要点四、植物的花药离体培养1、被子植物的花粉发育【高清课堂：植物组织培养技术高清未发布被子植物的花粉发育】要点诠释：①发育场所：被子植物雄蕊的花药中。

②分裂方式：花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此花粉是单倍体的生殖细胞。

③发育过程：被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期和双核期等阶段。

在小孢子四分体时期，4个单倍体细胞连在一起，进入单核期时，四分体的4个单倍体细胞彼此分离，形成4个具有单细胞核的花粉粒。

这时的细胞含浓厚的原生质，核位于细胞的中央（单核居中期）。

随着细胞不断长大，细胞核由中央移向细胞一侧（单核靠边期），并分裂成1个生殖细胞核和1个花粉管细胞核，进而形成两个细胞，一个是生殖细胞，一个是营养细胞。

生殖细胞将再有丝分裂一次，形成两个精子。

被子植物花粉的发育过程可以归纳为：花粉母细胞（或小孢子母细胞）−−−−→减数分裂4个小孢子（小孢子四分体时期）—→单核期小孢子（单核居中期—→单核靠边期）()−−−−−→有丝分裂每个小孢子双核期（花粉管细胞核和生殖细胞核）—→1个生殖细胞−−−−→有丝分裂2个精子。

也就是说，花粉萌发进行受精作用时，每个花粉粒可释放出两个精子，从而完成被子植物的双受精。

注意：每个花粉粒产生的两个精子基因型一般相同。

2、产生花粉植株的两种途径通过花药培养产生花粉植株一般有两种途径：这两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。

3、影响花药培养的因素（1）材料的选择：不同植物的诱导成功率很不相同。

就同一种植物来说，亲本植株的生理状况对诱导成功率也有直接影响。

花期早期时的花药比后期的更容易产生花粉植株。

一般月季的花药培养时间选在五月初到五月中旬，即月季的初花期。

选择合适的花粉发育时期也是提高诱导成功率的重要因素。

这是因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，在花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体刺激敏感。

一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。

选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破碎；选择单核期以后的花药接种，花瓣已有些松动，又给材料的消毒带来困难。

为了挑选到单核期的花药，通常选择完全未开放的花蕾。

盛开的或略微开放的花，都不宜选作实验材料。

（2）培养基的组成花粉培养所采用的培养基可因植物不同而有所变化。

培养基各成分中，植物生长调节剂的水平和配比，常对诱导细胞的分裂、生长和分化起决定性作用。

（3）亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响。

归纳：诱导花粉植株能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素的影响，其中材料的选择与培养基的组成是主要的影响因素。

要点五、月季的花药培养的实验操作1、材料的选取选择花药时。

一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。

常用的方法有醋酸洋红法、焙花青—铬矾法（某些植物的花粉细胞核不易着色，需要此方法，能将花粉细胞核染成蓝黑色）2、材料的消毒体积分数为70％的酒精浸泡约30 s →无菌水清洗→用无菌吸水纸吸干→放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中2 min ～4 min →无菌水冲洗3～5次。

3、接种和培养灭菌后的花蕾。