药剂灭菌 烧灼灭菌 辐射灭菌
液体培养基、蒸馏水
培养材料 器械、瓶口、棉塞、包头纸 接种室。培养间
（1）干热灭菌
适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方 法：150℃ 、40min或120℃ 、120min，如 果发现芽孢杆菌，160℃ 、90～120min
（2）湿热灭菌
适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、 棉塞、纸等。121℃ 维持20～30min 注意点：加足水、排尽气、气压降到0时， 才能开盖
（二）、灭菌的方法
1、物理方法：干热、湿热、过滤（0.25微 米）紫外灯、超声波等。 2、化学方法：使用灭菌剂或抗菌素，如酒 精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、 双氧水、福尔马林等
各种灭菌方法及其使用范围
干热灭菌 玻璃器皿、器械
湿热灭菌
熏蒸灭菌
培养基、蒸馏水、器械、棉塞等
接种室、培养室
过滤灭菌
2、细胞分裂素
是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（ 6-糠 基氨基嘌呤KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）和 玉米素（ZT）等。其中最常用的是6—苄基氨 基嘌呤。 功能： 1、促进细胞的分裂和分化 2、诱导芽的分化 3、促进侧芽的萌发和生长 4、抑制衰老

A
B
A：BA(0mg/L) ，芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量） B：BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量）
甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24小时进行，熏蒸后 密闭保持4小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、 鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。 取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入 熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛 味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前2 小时进行。 对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸
4、其它有机物质 1）肌醇（环己六醇） 肌醇可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质 另外还可以形成植酸，与阳离子结合或形成磷脂， 参与细胞膜的组成。利于胚和芽的形成 2）天然有机物 一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母提 取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表 现出了良好的促进作用。
（三）、植物生长调节物质
（4）射线灭菌
主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室 空气、操作台等，灭菌时间20～30min。 注意：关灯后5min后再进入。超净工作台 关灯后要打开风机。
（5）火焰灼烧灭菌
用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于 接种器皿的灭菌。
（6）消毒剂
适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。 几种常用消毒剂的效果比较
熏蒸灭菌
长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：甲 醛、高锰酸钾熏蒸。 甲醛的用量通常按每立方米空间2-6毫升计算， 高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后， 把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内(最好在碗或 杯下面铺一张报纸，以利清洗)，然后将甲醛也倒 入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液 即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部 分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲 醛挥发为气体。
生长素的生理作用
1、促进细胞生长和细胞分裂 2、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力 3、形成愈伤组织，促进生根 4、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定 芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱 导。
A
B
C
A：NAA 0mg/L，芽（少），根（无） B：NAA 0.1mg/L，芽（少），根（无），愈伤组织（少量） C：NAA 5.0mg/L，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量
（3）过滤灭菌
培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果 培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调 节剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、 血清等也需要过滤灭菌 灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度， 用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径0.22～0.45 微米。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降 至50℃左右时，加入适量的激素，然后分装。
4、用70－75％的酒精拭擦台面并消毒双手。试验 用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器 械在其火焰上灼烧，冷却待用。 注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。 金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能 灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不 能时间太长。
5、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊 子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回， 灼烧瓶口，盖上瓶塞。
1.3 灭菌室
配备高压灭菌锅、灭菌锅的选择应根据不同的 要求选择不同型号的灭菌锅。一般实验室可选用小 型的医用手提式高压灭菌锅，较大的实验室可选用 立式自动控制压力和温度的灭菌锅。生产性的实验 室可选用大型的卧式灭菌锅。 小的10万，大的45万。
1.4 无菌操作室
无菌操作室又叫接种室。通常由里外两间组成，外间 是缓冲间，用于准备工作，防止污染的作用。缓冲间 的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启， 以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间 内应该设有洗手池、鞋帽架、和柜子、紫外灯。无菌 操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员进 入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。 室内应配有超净工作台，紫外灯、解剖镜、各种 接种器械等。


植物激素是在植物体内合成的，对植物 生长发育有显著调节作用的微量有机物， 而植物生长调节剂是外源的调节植物生 长发育的物质。 无机元素和有机营养构成的培养基仅保 证培养物的生存与最低生理活动，只有 加入植物生长调节物质，才能诱导细胞 分裂、脱分化和再分化。
1、生长素类：
1）吲哚类：IAA（吲哚乙酸）、 IBA（吲哚丁酸） 、 IPA（吲哚丙酸） 2）萘酸类： NAA（萘乙酸） 3）苯氧羧酸类：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、 2,4,5-T（ 2,4,5-三氯苯氧乙酸）、 2,4,5-TP （ 2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。 其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最 强的生长素。
消 毒 剂 使用浓度(%)
75 10～20 0.1～1 10～12 4～50mgl-1 9 ～ 10
乙醇 新洁尔灭 氯化汞 过氧化氢 抗菌素 次氯酸钙/纳
消毒时间 (min.) 0.1-3 5～30 2～15 5～15 30～60 5～30
效 果
好 好 最好 较好 较好 好
残液去除 难易 易 易 最难 最易 较难 易
注意（1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必 太快，以防空气流动，增加污染机会。（2）不能用 手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或 取备品更换。 （3）为拿取方便，工作台面上的用品 要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在 右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（4）工 作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处 理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用 前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立 即封闭瓶口直立可增加落菌机会。
2、AA类物质 绝大多数AA适量时对培养效果都有正象效应。常用 的有Gly、Asn、Gln。在植物组织培养中，有时也 用水解乳蛋白和水解酪蛋白。
3、糖类
糖在培养基的作用： 1）、为细胞提供合成新物质的碳骨架 2）、为细胞的呼吸代谢提供底物和能量 3）、维持渗透压 蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常 用的碳源。
§1
实验室设置及仪器设备
实验室是进行组培研究的主要场所，须 满足洗涤、培养基制备、无菌操作、培 养、鉴定等工作。
1．基本实验室
1.1 洗涤间 根据生产量的大小决定其大小，一般面积控 制在30-50m2。在实验室的一侧设置专用的洗涤水 槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置2 个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大， 可以购置一台洗瓶机。地面应耐湿并排水良好。
三、无菌操作技术
人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。 器 皿 和 用 具 污染来源
培养皿：洗→热压 玻璃器皿：洗→干热（干热箱）或晾干 接种用具：用CCL4布擦→湿布擦→泡75%~9来自%酒精→烧培养基：湿热
物品因素
培 养 材 料
外部细菌：用水冲洗→化学药剂处理
内部细菌 茎尖培养 加抗生素：青霉素、利福平
接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜， 以免空气中微生物落入瓶中
正 确
错 误
整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要 迅速
正 确
错
误
防止操作带来的污染 接种过程中尽可能达到悬空要求
正
确
错
误
接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口
正 确
错
误
瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口
正
确
错
误
接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生
种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表 面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足
正 确
错 误
接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形 态学上端露于空气中
正 确
错 误
§3.培养基的成分及其配制
一、培养基的成分及其作用
（一）无机营养物质
培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需
要连续的供给某些无机化学物质，除了C、H、O之
操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸
1、实验器具和材料的准备 2、用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超 净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意：台 面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低 灭菌效果。 3、关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间， 以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。 进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下 工作台）
按需消毒空间每立方米用于苍术片(中药店 有售)1克计算，将苍术浸泡于95％酒精内， 酒精用量以淹没苍术为准，密封浸泡24小 时待用。消毒时将浸泡好的苍术置于1个或 2个耐高温容器内，点燃熏蒸2小时，每周 1次。需要注意的是，开始点燃时有5厘米 左右高的火焰，约持续2分钟。因此，需待 火焰灭后，观有淡淡的烟雾上升后室内方 可离人