2011届本科毕业生毕业论文题目：PH、金属离子在溶菌酶提取过程中对酶活性的影响作者姓名徐萧苟真汪磊指导教师刘秀丽学科专业生物技术系别生命科学与技术学院学号2007221121 20072211022007221115提交论文日期2011年6月2日PH、金属离子在溶菌酶提取过程中对酶活性的影响徐萧苟真汪磊指导老师：刘秀丽（陇东学院生命科学与技术学院甘肃庆阳 745000）摘要:本实验采用盐析法从鸡蛋清中提取溶菌酶，通过在提取过程中施以不同的PH和加入不同的金属离子，来测定其对提取的溶菌酶活性的影响。
结果表明酶活性在PH6.0-6.5最强、且在5-7范围内较稳定；金属离子中Na+、K+对其活性有轻微激活作用。
Mn2+、Mg2+对溶菌酶活性无明显影响，Ca2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+使溶菌酶活性下降。
关键词：盐析蛋清溶菌酶；酶活性；影响因素；金属离子；提取；PHPh, Metal Ions In Mind The Enzymes Are Extracts Of The Enzyme ActivityXuxiao gouzhen wanglei（Gansu College of Life Science and Technology, Biotechnology, 07 classes inQingyang 745000）Abstract: Objective To study the extraction process of egg white lysozyme PH, metal ions on enzyme activity levels.Methods: egg white lysozyme in the extraction process or by changing the PH by adding various metal ions the size of the different factors to determine the results of the activity of egg white lysozyme was observed enzyme activities. The results of activity of the strongest in the PH6.0-6.5 and was stable in the range 5.0-7.0; metal ions in the Na +, K + activation of its activity slightly. Mn2 +, Mg2 + had no effect on the activity of lysozyme, Co2 +, Ca2 +, Cu2 +, Fe2 +; Zn2 + is the activity of lysozyme decreased. Conclusion Preliminary results showed that acid extraction of lysozyme as part of the environment and enhance the metal ions for their activity and reduce the effectKeywords ：out truffles are an enzyme ;enzyme activity ; factors influencing Metal ion; extraction;pH;0引言溶菌酶(Lysozyme),正式名为N-乙酰基糖胺酶（N-lhexosaminodase）,属胞壁质酶（muramidase）, 有称N-乙酰胞壁质酶，能选择性地分解微生物的细胞壁而具有杀菌、抗病毒、抗肿瘤细胞等功效，在食品工业、医疗、生物学领域有着广泛的应用[1]。
当前、可以从牛、羊、马等动物乳汁中分离溶菌酶，从番木瓜、无花果、大麦、卷心菜等植物中也可分离溶菌酶。
溶菌酶在临床现象常用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。
在食品工业上中还可以作为防腐剂。
利用溶菌酶处理革兰阳性菌还可得到原生质体，因此，溶菌酶也是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。
因此，开发溶菌酶具有良好的经济价值和研究价值[2-4].国内上市制剂有溶菌酶含片和肠溶片两种，尚未有溶菌酶液体制剂上市。
目前使用的溶菌酶为鸡蛋清溶菌酶，为C型溶菌酶，从人乳汁、尿和胎盘中提取的溶菌酶也属于C型。
鸡蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白3.5%左右，作为溶菌酶类的典型代表是目前重点研究对象。
本文为了拓展溶菌酶应用，对蛋清溶菌酶的酶学活性质进行研究，探讨PH、常见金属离子对其在提取过程中活性的影响，以期提高酶提取纯度和酶活。
1 仪器与材1.1 材料溶菌酶(15000U/mg)、枯草芽孢杆菌、牛肉浸取物、蛋白胨、琼脂等；生化药品：PBS缓冲液、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、利丙酮等。
鲜鸡蛋：市售。
1.2主要仪器722型分光光度计、电子天平、离心机、超净工作台、烧杯、量筒、漏斗、离心管、定性快速滤纸、移液管（10mL）、移液枪、试管及试管架2 试验方法2.1培养基的配制2.11 液体培养基葡萄糖20g,蛋白胨15g,氯化钠5.0g，牛肉膏0.5g,琼脂20g,调PH至7.0，定溶于1L蒸馏水中，封装与三角瓶中，121℃灭菌15min。
2.12 固体培养基液体培养基加琼脂2%，调PH至7.0，置于1L水蒸馏中，加热溶解，封装于斜面中，121℃灭菌15min[5-6].2.2 蛋清液的配制选择新鲜鸡蛋，用水清洁掉蛋壳表面的不洁之物，破壳分离蛋清，将蛋清搅拌稠度均匀，以不引起泡沫为宜，防止蛋白质变性，用双层纱布滤去卵带和碎蛋壳。
2.3溶菌酶提取取一定量蛋清液，加入适量氯化钠同时搅拌均匀，再用1mol/L的氢氧化钠调节蛋清液pH10.0，加入少量溶菌酶作为晶种，4℃静置数天，溶菌酶晶体将析出，离心、干燥即得溶菌酶干粉。
2.4 酶活力测定方法2.41底物的制备在斜面培养基中取枯草芽孢杆菌接种于30ml液体培养基中，37O C,18h过夜培养， 5000r/min离心15min，弃上清液，收集菌体，用pbs缓冲液制成悬液。
2.42 酶液的制备准确称取干菌粉5mg，用0.1mol/L的pH6.2磷酸缓冲液溶解成50ml。
2.4.3 酶活力测定取6mL枯草芽孢杆菌的过夜培养物，3500rpm常温离心5分钟，弃上清，沉淀用6mL 0.02mol/L PBS缓冲液悬浮，利用可见光分光光度计测其OD450并记录（吸光度在0.5～1.0范围，如果读数过高可适当稀释）。
比色皿编号见下表，其中1只加入PBS作为仪器调零空白，2作为对照，3、4用于平行测定然后取平均值），30s测定一次吸光度值，约3min内至吸光度达到稳定。
比色皿 1 2 3 4PBS缓冲液/mL 3 - - -细胞PBS悬液/mL - 3 2.9 2.9- - 0.1 0.1分别用酶液S1～S4/mL在室温，以1号管为对照，每隔30s分别测定2、3、4在450nm的吸光度。
观察悬液OD450反应前后的变化。
根据以下的酶活定义，测定溶菌酶活性。
其中活力单位（U）：酶在室温（25℃），pH8.0条件下，以每毫克溶菌酶每分钟使吸光度降低0.001个单位为1个酶活力单位[7-9]。
将2.4.3酶活力测定结果作为对照。
2.5不同范围内的PH值对溶菌酶活性的影响的测定方法选择pH值为1.0-7.0的酸性环境和pH值为7-14碱性环境大范围的测定酶活性，测得pH范围在1.0-7.0，酶活性有上升趋势；在pH值为7-14，酶活性急剧下降。
在选择不同点的pH值做测定，分别选择4.0；5.0；5.5；6.0；6.5；7.0；8.0；9.0等不同pH值梯度的磷酸缓冲液测定其对酶活性的影响。
得结果绘制曲线图形，讨论不同pH值对酶活性的影响。
具体实验方法：分别在不同PH值的磷酸盐缓冲液中，在25℃下放置0.5h，测定溶菌酶活性。
加入不同条件的pH值，从加酶时开始记时，每隔30s测1次OD450值，共测3次，计算出平均值。
最后记录下不同范围pH条件下的酶活值。
2.6属离子对酶活性的影响的测定方法将溶菌酶液与底物混合，测定酶活力，作为对照。
然后将常见金属离子中的一种加入到溶菌酶液中，并保持每种金属离子的浓度都保持在0.01mol/L,与底物混合，并迅速摇匀，从加酶时开始记时，每隔30s测1次OD450值，共测3次，记录数据，取平均值。
每种金属离子都依上述方法依次加入，测三次，求平均值。
在25℃条件下放置0.5h后，以不加金属离子的酶液活性为参照计算相对酶活力。
3 测定结果3.1 不同pH在溶菌酶提取过程中对蛋清溶菌酶活性的影响结果图一结果见图一：由图一可知，蛋清溶菌酶在pH6.0~6.5活性最强，pH5.0~7.0范围内酶活性比较稳定，在pH大于7.0时酶活性急剧下降。
说明蛋清溶菌酶在酸性环境中稳定。
图一是根据溶菌酶中加入不同pH值，测定其酶活性，将不同pH条件下多次测得的酶活平均值与对照实验测的酶活的相对值作为图一的纵坐标，加入的pH值做为图一的横坐标。
根据不同条件下所得的值与坐标值对应，描述pH对溶菌酶提取过程的中酶活性的影响。
3.2不同金属离子在溶菌酶提取过程中对蛋清溶菌酶活性的影响结果结果如图二，实验表明，Ca 2+、Co 2+、Fe 2+、Zn 2+、Cu 2+金属离子均出现溶菌酶溶液沉淀现象。
金属离子中Na +、K +对其活性有轻微激活作用。
Mn 2+、Mg 2+对溶菌酶活性无明显影响，Co 2+、Ca 2+、Cu 2+、Fe 2+、Zn 2+是溶菌酶活性下降，后者可能使酶沉淀变性。
Fe 2+、Zn 2+存在下这种现象尤为明显。
结论 初步试验结果表明溶菌酶提取过程酸碱环境和有一部分金属离子对其活性有提升作和降低作用。
因此在溶菌酶制剂生产过程中应避免溶菌酶与金属离子接触[10-12]。
图二是0.01mol/L 金属离子对溶菌酶活性的影响，以纵坐标为相对酶活，横坐标为不同的金属离子，描绘出金属离子对酶活性的影响程度。
且以2.4.3测定的酶活作为对照值与加入不同金属离子的酶活值进行计算，获得相对酶活数值。
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