免疫组化原理及步骤
免疫组化操作规程
一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。

二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。

三、试剂配制
1. 0.01 M PBS（pH 7.34 ）：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml ；
1000 ml 0.2M PB （pH 7.4）＝5.93 g NaH 2 PO 4 2·H 2 O ＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B （A. 0.2 M NaH 2 PO 4 2·H 2 O ：15.6 g in 500 ml ddH 2 O ；
B. 0.2 M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O ：71.632 g in 1000 ml dH 2
O ）。

2. Citrate Buffered Saline （0.01 M 柠檬酸缓冲液，
PH6.0 ）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O （A.Citrate acid
（柠檬酸）：10.5 g
加双蒸水至 1000 ml ； B.Citrate sodium （柠檬酸钠）： 29.41 g 加 双蒸水至 1000 ml ）。

3. 细胞通透液：由终浓度分别为 0.3% 双氧水和 0.5%Triton X-100 混合而成。

配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS ，再接着 加 120 ul TritonX-100, 并加热一儿，冷却至临用前加 0.4 ml 30 ％ H 2 O 2 。

4. 5％羊血清或封闭血清，用 PBS 稀释。

5. 含 0.03 ％ H 2 O 2 的 0.05 ％DAB （避光） ：用 20×DAB （1％， 10 mg/ml ）5 ul ＋0.1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS 。

6.
一抗、二抗均用 PBS 稀释。

7. Xylene 、梯度 Ethanol （100 ％×2、95％、80％、70％、50％）、 双蒸水、中性树胶（封裱剂）。

8. 苏木精染液：
四、操作步骤
1 、脱蜡、水化
60 ℃× 20 min →Xylene 2 × 10 minut ；es 80% ethanol 2 minutes ； 70% ethanol 2 minutes ； distilled water:5 min ； PBS 洗 3 次×3 min 。

1)
2)
3)
4)
5)
6)
7) 100% absolute ethanol ：2 ×5 minutes ； 95% ethanol 2 minutes ；
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶
8）用封闭通透液浸润切片30 min （RT 避光）。

配法是用预热40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟后，临用前加400 ul 30％H 2 O 2 。

9） PBS 溶液洗 3 次×3 min。

3、抗原修复暴露抗原决定族
10）切片放入0.01 M 柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0 ）后，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，再加热约 6 min ×4 次，每次间隔补足液体，防止干片。

4、封闭非特异性蛋白
11） PBS 溶液洗 3 次×3 min ；
12）将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈, 在圆圈内组织滴入5% 羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min ；
5、一抗孵育
13）甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250 、500 、1000 ）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，从冰箱中取出需37 ℃复温45 min。

6、二抗孵育
14）将一抗倒掉并用PBS 洗 5 min ×5 次；
15）用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入
100% absolute ethanol: (1-2) min
37 ℃ 恒温烤箱中30 min （回收）。

16) 用PBS 洗 5 次×5 min ；
7、SP 反应
17) 加入SP 后放入37 度烤箱中30 min。

18) 用PBS 洗 5 次×5 min ；
8、显色
19) 加入DAB(快速滴入，观察染色情况，倒掉染液)，显色时间
控制在约 5 min (3～10 min )，由镜下观察颜色控制时间。

0.05％DAB(避光)(1:20 储备液)：5 ul 20 D×AB ＋0.1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS 。

1%DAB 储备液的制:50mgDAB+5ml 0.05 mol/L PBS 充分溶解，-20 ℃保存。

9、复染、脱水、透明、封片
20) 用PBS 3 次×3min 后，用双蒸水洗 5 min ；
21) 加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染20 s 后自来水冲洗，
双蒸水洗 5 min ，再用PBS 返蓝 5 min。

22) 脱水：
50% ethanol 1-2 min ，
70% ethanol 1-2 min
95% ethanol 1-2 min ；
95% ethanol 1-2 min ；
100% absolute ethanol: (1-2) min
100% absolute ethanol: (1-2) min ；
23) 透明：Xylene 1 ×(1-2) min →Xylene 2 ×-(21) min
24) 封片：中性树胶。

五、注意事项
1. 苏木素复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核上。

2. DAB 显色时间需要达到最优化，镜下观察达到阳性染色明显
但背景不太深。

3. 抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。

尤其一抗孵育最好在 4 度过夜。

4. 切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片；用组化笔画圈时尽量画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干片。

5. 片子着色不均匀的原因如下：
①脱蜡不充分。

可以60 ℃烤20 min ，立即放入新鲜的
xylene1 ；
②水化不全。

应经常配制新鲜的梯度乙醇；
③抗体没混匀。

用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；
④抗体孵育时，切片放倾斜；
⑤抗体孵育后PBS 冲洗不充分。

⑥制片厚薄不均匀等问题。

染片盒不平，切片倾斜。

6. 一抗从 4 ℃拿出后，为什么有人说要37 度复温，目的是什么？
①一方面，防止切片从 4 ℃直接放入PBS 易脱片；② 另一方100% absolute ethanol: (1-2) min
面，使抗原抗体结合更稳定。

一般不需要,但对表达较弱的抗原可能
有用,4 ℃和37 ℃度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运
动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染
色。

7. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？
① 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。

这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制；
②一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；
③内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
④非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免
疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
⑤DAB 显色时间过长或浓度过高；
⑥PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；
⑦标本染色过程中出现干片，易增强非特异性着色。