免疫组化
一实验目的:分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况
二实验原理: 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术.
三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB 显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等
四实验设备:切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机
五主要试剂配置:
缓冲液
应用液A NaH2PO4 38.4g配成1000毫升溶液
应用液B Na2HPO4·12H2O 114.8g配成1000毫升溶液
配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液,36毫升应用B液,加8.5gNaCl。
枸橼酸钠抗原修复液
应用液A 枸橼酸 10.55g配成1000毫升溶液
应用液B 柠檬酸三钠(三水合柠檬酸三钠) 29.01g 配成1000毫升溶液
配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液,41毫升应用B液。
苏木素染液配方:苏木素2g,无水乙醇250毫升,硫酸铝17.6g蒸馏水750毫升,碘酸钠0.2g,冰醋酸20毫升。
先将苏木素溶于无水乙醇,再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。
两液溶解后将其混合,加入碘酸钠,最后加入冰醋酸。
抗体说明书建议的抗体稀释度
N-Ras 1:50-1:500
H-Ras 1:50-1:500
K-Ras 1:20-1:200
六实验步骤:
1组织常规石蜡切片厚度3-5um,防脱片捞片后晾干,放入72℃烤箱烤片2小时。
2 切片脱蜡水化程序
⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟;
⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟;(洗二甲苯)
⑶ 95%乙醇3分钟;
⑷ 85%乙醇3分钟;
3 自来水漂洗3分钟,洗涤一定要充分。
4 组织修复采用高温高压法:压力锅中加入pH 6.0 ,0.01M抗原修复液约1000ml,切片
插入塑料架上,放入压力锅,盖上锅盖(此时不扣上压力阀)1600W预热至沸腾,扣上压
力阀1300W,待高压锅阀门喷气开始计时,修复时间为2分钟。
5 停止加热并用流水冲洗高压锅以降温,室温冷却。
6将抗原修复后切片置自来水中,浸泡2分钟。
将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂3%H2O2,室温放置4分钟。
(需要盖盖子)自来水洗2分钟,PBS缓冲液洗涤2分钟。
7 取出切片,擦干组织周围液体后滴加10%BSA封闭液,37℃孵育40分钟。
滴加一抗(浓
度配比,PBS稀释1:20、1:50、1:100、1:200)60ul,注意保持组织湿润状态但表面不能有液体,用试管使抗体全部覆盖组织面且不能有气泡,以使抗体能全部与组织接触。
8 滴加一抗后放入专用孵育盒内,4℃冰箱过夜。
9 切片放入PBS缓冲液中清洗3分钟×3次,充分洗涤,防止因洗涤不净引起的非特异性
染色。
(前两次的PBS倒掉)
10擦干组织周围液体后滴加70微升辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物(根据实际情况要求覆盖样本),37℃温箱内孵育40分钟。
PBS缓冲液洗涤3分钟×3次.
11 显色,滴加现配适量DAB显色剂(在1ml试剂2(DAB底物液)中,加入1滴(约50ul)试剂1(DAB浓缩液),混合液,即配成DAB工作液),配置DAB显色剂的容器在冰冻切片机旁边的冰箱里,其它试剂在入门口冰箱。
室温显色,5-20分钟。
自来水终止显色。
第一
遍的自来水需集中处理,自来水洗涤3分钟。
12 复染,苏木素染液中染色40秒,水洗1分钟。
13 1%盐酸酒精溶液分化3秒,流水漂洗。
14 蓝化10秒,流水漂洗。
15 脱水,切片依次置于85%乙醇,95%乙醇各1分钟,无水乙醇Ⅰ、Ⅱ中各2分钟。
16 透明,切片依次置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各2分钟
17 中性树胶封片。