不育机制研究材料：安农N及其自发温敏不育突变体安 农S-1(AnS-1)
3.1 温敏不育形态学观察
可育
可育
可育
不育
3.2温敏不育细胞学观察
23℃
28℃
花
花
粉
粉
母
母
细
细
胞
胞
粗
二
小
线
线
分
孢
期
期
体
子
早
期
3.3 不育基因tms5定位及功能研究
构建F2(AnS-1× 9311) ;NIL5/NIL8 （9311）进行基因定位，发现基因 tms5 (Os02g0214300)的CDS区71bp处C→A的碱基颠换引起基因编码 提前终止（TCG TAG)。 通过免疫印迹发现该基因编码蛋白在AnN中出现，而AnS-1中未出现。
温敏雄性不育系AnS-1在两系制种中应用广泛（~70%），其 育性转换温度的起始点为 25℃, 即环境温度高于 25℃时, 其花粉 表现为不育； 而环境温度低于 25℃时, 表现为可育, 并且研究表 明温敏不育性受隐性单基因tms5控制，初步定位于第2染色体短 臂上。但目前tms5仍未被克隆，其产生核不育的具体机制尚不 清楚。
3.6 UB L40引起水稻温敏不育机制探究
✓通过mRNA原位杂交，检测UB L40表达的时空特异性。
✓构建UB L40 1和UB L40 4过表达载体 ，发现在他们高表达 的植株出现类似温敏不育。
✓通过基因敲出UB L40 1/UB L40 4 ，发现他们低表达时植 株出现部分育性恢复。
四、结果与分析
内切核酸酶RNase ZS1过表达引起
水稻温敏核雄性不育
刘永明 S20131237 四川农业大学 生物化学与分子生物学
一 目的意义 二 技术路线 三 材料方法 四 结果与分析
一、目的意义
水稻温敏雄性不育：上世纪70年代于我国发现一种水稻的育性转换与 日照长短和温度高低有密切关系，即在长日高温条件下，它表现雄性 不育;在短日平温条件下，恢复雄性可育，由此这种水稻被命名为光温 敏雄性不育系（Thermosensitive genic male-sterile ，TGMS），该性状受 细胞核内一对隐性基因控制。
3.4 tms5下游基因发掘及功能研究
通过全基因组微阵列和RNA seq发现tms5植株中三条mRNA序列，它 们在22度条件permissive temperature）下丰度低，而在30度条件 (restrictive temperature)下丰度高。
泛素化基因： • UbL401 (Os09g0452700) UB L40 I • UbL402 (Os03g0259500) UB L40 2 • UbL404 (Os09g0483400) UB L40 4
D 全基因组微阵列、RNA seq寻找tms5下游靶基因:UB L40 I/ UB L40 2 /UB L40 4
E 鉴定候选基因对目标基因调控机制：原核表达 ，mRNA原位杂交,UB L40 过 表达及敲出
三、材料方法
研究材料： 不育基因定位群体：F2(AnS-1× 9311) ;NIL5/NIL8 （9311）
UbL40基因受高温诱导并 在花粉母细胞特异表达。
3.5 tms5与UB L40互作研究
通过原核表达，发现在含有RNase ZS1编码蛋白中三个UB L40基因产 物都降解成小片段，而在不含有Rnase ZS1编码蛋白中不发生降解。 通过RNA连接酶介导的5’RACE在UB L40 1 中得到多个剪切位点。这些 剪切位点在AnN中出现，但AnS-1却没有。
揭示了RNase ZS1介导调控
UbL40 mRNA的一种新机制，
证实在水LOW稻中这种调控的
HIGH
丧失导致了TGMS。
HIGH
非差异表达调控基因
Idea 调控基因功能正常 调控基因功能丧失
野生型
突变型
下游差异 表达基因
A
高表达
B
低表达
THANKS
谢谢观看！ 2020
本文克隆了安农S-1温敏不育基因tms5，并阐述了其引起核 不育的具体机制，证实大部分的温敏不育水稻都是使用tms5作 为不育基因。
二、技术路线
A 形态及细胞学观察，确定温敏不育特征
B 利用F2及NIL群体进行不育基因定位,克隆候选基因tms5(Os02g0214300)
C 候选基因功能研究：1 转基因功能互补验证 2 利用同源序列并结合原核表达 鉴定其具有核酸内切酶功能 3 GFP与免疫印迹进行亚细胞定位，确定基因作 用部位
转基因验证 功能互补：将TMS5即基因Os02g0214300在AnS-1（tms5)中进行表 达，发现其花粉育性得到恢复（28 ℃ ）。
RNAi:通过RNA干扰抑制TMS5的功能，在Zhonghua11与Nipponbare 出现了温敏不育的特征。
TMS5编码核酸内切酶RNase ZS1
通过亚细胞定位和免疫印迹发现RNase ZS1在 细胞质中发挥作用，但具体功能未知。