本科生课程论文论文题目：基因治疗______课程名称：分子遗传学____任课老师：__专业：生物技术班级：2010级___ ___学号：姓名: _____2012年12月24日基因治疗胡志刚学号：222010326022006西南大学农学与生物科技学院，重庆400715摘要：基因治疗是一种新的治疗手段，近年来被逐渐应用于癌症、遗传病等顽固疾病的治疗中。

在临床应用中也遇到了很多困难，如其靶向性，转移效率较低等问题亟待解决，其安全性更是长期困扰着人们。

本文主要对基因治疗的一般方法步骤、基因治疗存在的问题和前景进行了综述。

关键词：基因治疗载体遗传病癌症Gene therapyHu Zhi-Gang Student ID:222010326022006College of Agronomy and biotechnology,Southwest China Normal University, Chongqing 400715, ChinaAbstract: Gene therapy is a new treatment in recent years is gradually applied to the treatment of cancer, genetic diseases and other intractable diseases. Also encountered a lot of difficulties in clinical applications, as it targeted, lower transfer efficiency problems to be solved, and its security is long plagued people. This paper focuses on the general steps of gene therapy, gene therapy problems and scenarios are reviewed.Keywords: gene therapy;the carrier,;genetic diseases; cancer1 基因治疗的定义基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。

也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。

从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。

2 基因治疗的一般方法与步骤2.1目的基因的选择和制备基因治疗的首要问题是选择用于治疗疾病的目的基因。

对遗传病而言只要已经研究清楚某种疾病的发生是由于某个基因的异常所引起的，其野生型基因就可被用于基因治疗，如用ADA基因治疗ADA缺陷病。

但在现在的条件下，仅此是不够的。

可用于基因治疗的基因需满足以下几点：（1）在体内仅有少量的表达就可显著改善症状；(2)该基因的过高表达不会对机体造成危害。

在抗病毒和病原体的基因治疗中。

所选择的靶基因应在病毒和病原体的生活史和起重要的作用并且该序列是特异的，如针对HBV的HBeAg或X基因等。

肿瘤病人多有免疫缺陷，可选用免疫因子基因转入人体，肿瘤细胞内往往存在多种基因异常形式，可采用反义技术封闭细胞内活化的癌基因或向细胞内转入野生型抑癌基因，抑制肿瘤生长，所针对的癌基因或抑癌基因应下该肿瘤的发生和发展有明确的相关性。

2.2基因的转运目前已有多种基因转运的方式，其基本原则是将外源基因运到细胞内。

已使用的有病毒载体和非病毒载体两大类。

病毒载体：病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解；RNA病毒能整合到染色体以及基因水平较高等。

因此病毒载体是良好的基因转运载体。

目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关的病毒。

疱疹病毒和肝炎病毒等。

逆转录病毒用作载体时需进行几步改造：（1）将天然的野生型RNA前病毒转变成DNA载体，并插入欲转移的相关外源基因。

其基本原则是用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因，（2）制备辅助细胞为载体DNA提供其丧失的功能。

（3）将载体DNA导入辅助以产生病毒载体。

（4）病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表达。

2.3靶细胞的选择理论上讲，无论何种细胞均具有接受外源DNA的能力，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞。

在实际上应用中应具体根据目的条件选择。

这里所指的靶细胞是指接受转移基因的体细胞。

选择靶细胞的原则是：①必须较坚固，足以耐受处理，并易于由人体分离又便于输回体内；②具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，最后可延续至病人的整个生命期；③易于受外源遗传物质的转化；④在选用反转录病毒载体时，目的基因表达最好具有组织特异性的细胞。

目前使用得较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。

2.4细胞转染将目的基因导入靶细胞的方法很多，大致可分为物理学方法、化学方法、融合法和病毒感染法四类。

2.4.1化学法：将正常基因DNA（及其拷贝）与带电荷物质和磷酸钙、DEAE －葡萄糖或与若干脂类混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，直接倾入培养基中与细胞接触，由于钙离子有促进DNA透过细胞有作用，某些化合物可扰乱细胞膜，故可将DNA输入细胞内，并整合于受体细胞的基因组中，在适当的条件下，整合基因得以表达，细胞亦可传代。

这种方法简单，但效率极低，一般1000－100000个细胞中只有一个细胞可结合导入的外源基因。

要达到治疗目的，就需要从病人获得大量所需的受体细胞。

当然，可以通过选择培养的方法来提高转化率。

2.4.2物理法：包括电穿孔法和直接显微注射法。

①电穿孔法[1]：电穿孔法是将细胞置于高压脉冲电场中，通过电击使细胞产生可逆性的穿孔，周围基质中的DNA可渗进细胞，但有时也会使细胞受到严重损伤。

②显微注射法：显微注射是在显微镜直视下，向细胞核内直接注射外源基因，这种方法应是有效的。

但一次只能注射一个细胞，工作耗力费时。

此法用于生殖细胞时，有效率可达10%。

直接用于体细胞却很困难。

③脂质体法：脂质体法是应用人工脂质体包装外源基因，再与靶细胞融合，或直接注入病灶组织，使之表达[2]。

2.4.3同源重组法：同源重组是将外源基因定位导入受体细胞的染色体上，在该座位因有同源序列，通过单一或双交换，新基因片段替换有缺陷的片段，达到修正缺陷基因的目的。

2.4.4病毒介导基因转移：前述的化学和物理方法都是通过传染方式基因转移。

病毒介导基因转移是通过转换方式完成基因转移，即以病毒为载体，将外源目的基因通过基因重组技术，将其组装于病毒上，让这种重组病毒去感染受体宿主细胞，这种病毒称为病毒运载体。

目前应用的有两种病毒介导基因转移方法。

①反转录病毒载体：反转录病毒虽是RNA病毒，但有反转录酶，可使RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。

②DNA病毒介导载体：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒、疱疹病毒等，一般认为这类病毒难于改造成缺陷型病毒。

2.5外源基因的表达及检测在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。

其中包括对目的基因和标记基因表达的鉴定。

常用方法有原位杂交，Northrn杂交，NRA 打点杂交，免疫组织化学染色等，前几项是检测外源基因转录出的mRNA，后者则是检测外源基因翻译出的蛋白质。

流式细胞仪是一种较为客观准确的仪器，可定量分析外源基因的表达状况。

3 基因治疗的应用近年来基因治疗被逐渐应用于普通疗法难以治愈的疾病，如肿瘤、艾滋病和遗传病，并在这些领域内取得了令人惊喜的成绩。

3.1复合免疫缺陷综合征的基因治疗1991年美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案，即将腺苷脱氨酶（ADA）导入一个4岁患有严重复合免疫缺陷综合征（SCID）的女孩。

采用的是反转录病毒介导的间接法，即用含有正常人腺苷脱氨酶基因的反转录病毒载体培养患儿的白细胞，并用白细胞介素Ⅱ（IL－2）刺激其增殖，经10天左右再经静泳输入患儿。

大约1－2月治疗一次，8个月后，患儿体内ADA水平达到正常值的25%，未见明显副作用。

此后又进行第2例治疗获得类似的效果[3]。

3.2黑色素瘤的基因治疗对肿瘤进行基因治疗是人们早已期望的事，在进行了多方面探索的基础上，发现了肿瘤浸润淋巴细胞在肿瘤治疗中的作用。

于1992年实施了TNF/肿瘤细胞和IL－2/肿瘤细胞方案，即分别将IL－2基因肿瘤坏死因子基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞，再将这些培养后的肿瘤细胞注射至病人臀部，3周后切除注射部位与其引流的淋巴结，在适合条件下培养T细胞，将扩增的T细胞与IL－2合并用于病人，结果5名黑色素瘤病人中1名肿瘤完全消退，2名90%的肿瘤消退，另2人在治疗后9个月死亡。

由于携有TNF的TIL可积于肿瘤处，因而TIL的应用提高了对肿瘤的杀伤作用。

3.3其它遗传病的基因治疗其它遗传病诸如白种人中常见的囊性纤维化的进展很快。

对于DMD的基因治疗，由于有小鼠动物模型，也取得一定进展。

例如1993年法国将Ad-RSVmDys（腺病毒－罗斯病毒小肌营养不良蛋白基因重组体）注入小鼠肌内成功。

即用腺病毒为载体，与小肌营养不良蛋白（minidystrophin）基因的cDNA重组，在RSV启动子启动下，作肌肉注射，证明可在mdy小鼠肌肉表达，此外，对一些遗传病如血友病，地中海贫血、高雪氏病等正在探索中。

基因治疗存在的问题及展望4 基因治疗存在的主要问题及展望4.1用于治疗的基因过少目前在已用于临床实验的治疗基因仅集中于少数基因，对大多数疾病致病基因有待阐明。

这不仅限于致病基因的发现，同时也包括已知和目前未知功能基因的表达调控序列的确定，以及其相互作用规律的阐明，这将有赖于人类基因组计划、尤其是功能基因组学的发展。

4.2基因治疗缺乏靶向性基因治疗的关键中的首要问题是能将治疗基因输送到并进入特定靶细胞，从而要能在该细胞中得到高效表达。

4.3载体转移基因的效率导入基因的持续表达及表达效率的问题。

日前基阗治疗没有获得满意的结果。

目的皋囚在体内不能持续表达和表达水平不高是其重要的影响因素之一。

构建转移效率和表达水平均高的载体是今后基因治疗研究的一个重要方向。

4.4受体细胞的研究目前采用的基因标记或基因治疗计划多数采用体外基因转达移方法，但是人体细胞在体外进行长期培养和繁殖，细胞的生物行为是否改变是值得研究的问题。

1991年，Rosenberg等采用肿瘤浸润淋巴细胞(tumor—infiltrating lympho—cytes，TIL)基因转移技术治疗肿瘤，这些加T后的r11IL并不像想象那样聚集存肿瘤组织附近，识别并杀伤肿瘤细胞，却大量集结在肝脏和肾脏中，所携带的细胞因子TNF的表达也只有预期的1/4。