生物测试(bioassay)指系统地利用生物的反应测定一
种或多种污染物单独或联合存在条件下，所导致的影
响或危害。
所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个
体、种群、群落-生态系统各级水平上的反映。
13
（二）毒性试验的方式 1.毒性试验的分类 根据毒性试验所经历的时间长短：短期毒性试验，中 期毒性试验和长期毒性试验。 根据试验溶液或试验气体的给予方式：静止式毒性试 验和流动式毒性试验。
29
(二)荧光原位技术的基本过程
1.制备和探针标记：
常用的探针信号标记方法有两种： ①直接标记法。将荧光分子直接标记于探针DNA/RNA 上，杂交后可直接在荧光显微镜下检测。 ②间接法。采用一中间分子标记探针，杂交后再用荧 光分子标记的中间分子的亲和物或抗体进行检测。
30
2.染色体原位杂交 杂交前变性处理染色体标本，使染色体DNA变为部 分单链，并去掉附着的RNA及蛋白质，变性处理生
八、RAPD技术在DNA损伤检测中的作用
21
一、PCR—SSCP技术
(一)PCR—SSCP的基本原理 单链DNA由于有链内碱基配对而具有一定的空间 结构，当DNA链上的碱基(即使是一个碱基)发生 改变时，单链DNA会形成不同的构象，称为单链 构象多态性(single strand conformation
28
二、荧光原位杂交技术
(一)荧光原位杂交的原理及特点
荧光原位杂交(fluorescene in situ hybridization， FISH)是20世纪80年代在原位杂交基础上建立起来的 一种高度灵敏、特异性好以及分辨率强的染色体和 基因分析技术，它通过荧光标记的各类DNA和RNA 探针与细胞或组织在玻片上进行杂交，在不改变其 结构的情况下，进行细胞内DNA、RNA某特定序列 的测定，可用于染色体识别、基因定位和基因诊断、 染色体结构畸变和数目改变分析。
(一)蓄积系数法 蓄积系数法(cumulative coefficient method)是一种常 用来评估环境污染物蓄积作用的方法。 蓄积系数(comulative coeficient，K)是分次给受试物 后引起50％受试物出现某种毒效应的总剂量(以 ∑LD50(n)表示)，与一次给受试物后引起50％受试动 物出现同一毒效应的剂量(以LD50表示)的比值，即
电场
离开核DNA
在凝胶中，向阳极运动
彗星图像
352.操作过程Fra bibliotek3637
38
Stain with EB solution and analyzed with a fluorescence microscope
39
3．SCGE结果分析
在SCGE中，未受损伤细胞表现为一圆形荧光核心， 即营星头部，无尾。而受损细胞则有莹星尾从核中 伸向阳极，形成一个亮的荧光头部和尾部。 分析方法主要是对显微负片进行测量，如望星长度、 头部直径、面积。描述窘星整体和头尾各部的特征。
和功能，也可以被应用于污染物生态系统。
18
对污染生态系统的研究，
①可以研究污染物对生物和非生物组成的影响
②污染物在生物和：非生物组成中的分布；
③研究污染物对生物—生物和生物—非生物之间相
互作用。
④研究的污染物包括有毒化学污染物如杀虫剂，营
养元素如氮、磷等。
19
二、水生微宇宙毒性试验
标准化水生微宇宙
11
方法是生物体接触受试物后，在一定间隔时间内分别 测定血液或尿液、器官组织中该物质的浓度，依据所 得结果按下式求出它的生物半衰期。 T1/2=(t1-t2) ㏒2/(㏒y1-㏒y2) y1y2分别为给受试物后于t1和t2时间测得该物质的浓度 或量。
12
四、毒性试验的方式及其标准化
(一)生物测试的定义
（四）哺乳动物急性毒性试验
6
二、亚慢性和慢性毒性试验
(一)亚慢性毒性试验
亚慢性毒性试验(subchronic toxicity test)是研究试验 动物在多次给以受试物时所引起的毒性作用，试验期 通常为动物生命期的l／3～1／10，大鼠一般为3-6个 月，狗为4—12个月。
其目的是为了进一步研究受试物有无蓄积作用，试验 动物对该物质能否产生耐受性，初步估计出现毒性作 用的最小剂量和不出现毒作用的最大剂量。
4
（一）水生生物急性毒性试验
1. 鱼类毒性试验 2. 水蚤类急性毒性试验
3. 藻类急性毒性试验
（二）植物急性毒性试验
1. 种子发芽和根伸长的急性毒性试验 2．陆生植物生长急性毒性试验
5
（三）陆生生物的急性毒性试验
1. 家蚕急性毒性试验
2. 蜜蜂急性毒性试验
3. 蚯蚓急性毒性试验
4. 鸟类急性毒性试验
7
(二)慢性毒性试验 慢性毒性试验(chronic toxicity test)是指以低剂量外来 化合物，长期与试验动物接触，观察其对试验动物所 产生的生物学效应的试验。
通过慢性毒性试验，可确定最大无毒作用剂量，为制
定人体每日允许摄入量(ADI)和环境最高容许浓度
(MAC)提供毒理学依据。
8
三、蓄积毒性试验
32
(三)荧光原位杂交技术在生态毒理学研究中的应用 1．检测中期细胞染色体畸变
2．检测间期细胞柒色体畸变
3．微核来源鉴定
33
朱宝生等（2000年）利用荧光 原位杂交检测慢性粒细胞白血 病的染色体畸变，病例的骨髓 细胞核型为46，XY，inv(2)(p 21-q13)，无bcr/abl融合基因， 其abl基因和bcr基因各自存在 于9号染色体和22号染色体的正 常位置上。
K＝∑LD50(n)/LD50(1)
比值愈小，表示蓄积作用愈强。
9
(二)20天蓄积试验法
浓度LD50 1／20 l／10 1／5 1／2 0
染毒天数
剂量—反应关系 有
20
无
20
20
20
有
20
死亡情况
蓄积作用
有
中等
无
无
有
较强
10
(三)受试物生物半衰期测定法 生物半衰期(T1／2)是指一种外来化合物在体内消除到 原有浓度的50％所需要的时间。 因此，生物半衰期越长的物质，表示越不易由生物体 内消除，其蓄积作用的可能性就越大。
(三)PCR—SSCP分析技术的特点 PCR—SSCP技术的原理明确，操作简单，不需要 特殊仪器，技术容易掌握； 试验步骤少、速度快、周期短； 检测灵敏度高，一般无假阳性结果；可运用于大样 本筛选； 可有效检测PCR产物中两侧引物问的基因变异，既 可检出单碱基置换，又可检出多碱基插入或缺失等； 对已知或未知基因变异的检测均有效。
在统计时应用响应或响应混合评价(即用Lehman转换 打分方法)
40
4．SCGE影响因素分析 (1) (2) (3) 细胞周期 受试物 氧效应
41
5．单细胞凝胶电泳技术在生态毒理学研究中的应用 (1)DNA损伤与修复的研究 (2)遗传毒性评价 (3)生物监测
(4)细胞凋亡的研究
42
(二)DNA—加合物的测定 DNA加合物的形成是生物体对外源物质的吸收、代 谢等诸多过程的综合结果，它一旦逃避自身的修复， 就可能成为化学致癌、致畸、致突变性的最小因子。 DNA的这种加合损伤是DNA化学损伤的主要形式之
烧杯水生微宇宙
室外水生微宇宙
三、土壤微宇宙毒性试验
土壤核心微宇宙
模拟农田生态系统
20
第三节 分子及细胞生态毒理方法
一、PCR-SSCP技术
二、荧光原位杂交技术
三、 DNA损伤试验 四、基因芯片技术 五、一般代谢酶的活性测定 六、解读系统酶类诱导作用的检测
七、抗氧化防御系统检测
1. PCR扩增
用γ—32P—ATP标记物或直接在反应体系中加
α-32p-ATP进行PCR扩增，使产物信号大大增强。
2. PCR产物单链凝胶电泳 实验多采用0.5％—0.8％凝胶，电泳时间需要参考 PCR产物长短、凝胶浓度、甘油浓度和温度来定。
25
3. 结果分析 PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性 产生单链，单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不 同，—般形成两条单链带。变性不彻底时，残留 双链亦可形成一条带，所以，PCR-SSCP分析结 果常可见到三条带。 残留双链带的相对位置因PCR产物碱基顺序和电 泳条件不同而异，可位于单链带之间，亦可位于 单链带一侧。如果与正常对照相比，两条单链形 成的条带相对位置有了改变，则表明有碱基突变 存在。
第三章 生态毒理学研究方法
第一节 第二节
常规毒性试验 微宇宙毒性试验
第三节
第四节
分子及细胞生态毒理方法
生物致突变效应检测
2
第一节
一、急性毒性试验
常规毒性试验
二、亚慢性和慢性毒性试验
三、蓄积毒性试验
四、毒性试验的方式及其标准化
3
一、急性毒性试验
急性毒性试验（acute toxicity test)：研究化学物质大 剂量一次染毒或24h内多次染毒生物所引起的毒性试 验。 目的： ①确定化学物的致死剂量，评价化学物对机体的急性 毒性的大小、毒效应的特征和剂量-反应(效应)关系， 并根据LD50 值进行急性毒性分级。 ②为亚慢性、慢性毒性研究及其他毒理试验染毒剂量 的设计和观察指标的选择提供依据，为毒作用机制研 究提供线索。
polymorphism，SSCP)。
22
相同长度的DNA单链因其顺序不同，甚至单个碱 基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同， 故DNA链中的单个碱基的突变可因其导致单链 DNA构象改变而通过电泳被检测出来。
23
PCR—SSCP是PCR技术与SSCP的结合，是将被
检出的DNA事先经有标志物的引物或有标志的脱
一。