膜挤向外膨出呈“水泡状”。核仁在早期增大,
其内含物解聚为一团云雾状的嗜酸性颗粒,分布
异常。同时胞质也发生浓缩,但结构尚清晰可辨。
进一步发展,细胞表面形成数目不等、大
小不一的细胞突起,使细胞外形略呈星状；核膜
扭曲内摺,并发生断裂,致使核碎裂为大小不等 的颗粒或碎块而分散于细胞中。此时,细胞体积 缩小,胞质内的细胞器,特别是线粒体与核糖体, 互相挤靠,但仍保持完整结构,内质网有时扩张, 并进而与表面的质膜融合。
(二)DNA依赖蛋白激酶
DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)是一种哺乳
类蛋白质丝/苏氨酸激酶,位于细胞核。其激活
有赖于DNA片段与之结合,故称为DNA依赖性 蛋白激酶。
DNA-PK是caspases-3(CPP32)的作用底物, 后者主要催化DNA-PKes(催化亚单位)的降解与 断裂,而不作用于DNA-Pkku亚基。DNA-PKes 的断裂,一方面可导致细胞对DNA修复能力下
也是细胞凋亡的重要组成部分。
一、内切核酸酶
内切核酸酶(endonuclease )简称DNase,目前 报道已有4种以上的DNase,如DNaseI、DNaseII、 DUC18、NUCL DNase r、NUC40、NUC58等。
该酶可被钙镁离子激活,也能被锌离子、乙二胶四
乙酸(EDTA)、焦碳酸二乙醋(diethylpyrocarbonate,
的微环境,所以不引起炎症反应或局部的组织
损伤；坏死时细胞内容物外溢,引起炎症反应和
继发性组织损伤。
⑥ 凋亡不诱发细胞的再生修复, 坏死通过
不同机制刺激细胞的再生修复。
第三节、细胞凋亡的酶学基础
从生物化学水平来看,细胞凋亡的形成与
其独特的酶学作用是分不开的。细胞凋亡的酶
学变化,不仅是认识细胞凋亡的重要途径,而且
亡是功能上的概念,凋亡是形态上的概念,但不
是所有程序性死亡都表现为凋亡,即不一定存
在调亡的形态学变化。所以不要将这两个名词
作为同义语使用。
从细胞受到凋亡诱导因素的作用到细胞凋亡大致 依次可分为四个阶段： ①凋亡信号转导; ②凋亡基因的激活; ③细胞死亡(凋亡); ④凋亡细胞的被清除。 此过程需时数分钟至数小时不等。
又如PKC的活化剂甘油二酶(DAG)可抑制
TNF和神经酰胺诱导的HL60细胞凋亡。
反之,用PKC的抑制剂可促进细胞凋亡的发 生,如PKC抑制剂叉抱素(stauroporine)和他莫昔 芬(tarnoxifen)能促进神经胶质瘤瘤细胞凋亡。
另有实验表明,PKC可以有效地防止内皮细胞因
成纤维细胞生长因子(FGF)或培养上清中的血 清撤除时所发生的细胞凋亡过程。
这被作为判断有无凋亡发生的客观指标之一。
DNA裂解片段和细胞凋亡数呈正相关。 线粒体DNA并不裂解,表明核染色质裂解是核 的特异性表现。在细胞坏死的晚期,也可测到核 染色质DNA降解 (degradation),但电泳图上为连
续图谱。
二、Caspases蛋白酶
白 细 胞 介 素 1β 转 化 酶 (interleukin-1β
③坏死与凋亡的组织学改变有明显不同：
坏死一般为连续性大片细胞和组织,细胞膜完整
性破坏、胞质肿胀、核染色质凝聚成块状、细
胞器肿胀破坏、坏死细胞崩解; 细胞凋亡则多
为单个散在细胞,细胞膜保持完整性、胞质及核
染色质致密、细胞器结构完整,并形成凋胞凋亡
时, 细胞核内限制性内切核酸酶活化,活化了的内
90年代以来,生物学家逐渐认识到细胞凋 亡有特殊的生物学意义,并且与某些疾病(包括 肿瘤)的关系密切,因而成为医学生物学领域里 又一新的研究热点。 本章除主要介绍细胞凋亡的基本理论知识
及其与肿瘤发生的关系外,还介绍了几种常用的
细胞凋亡的检测方法。
第一节 细胞凋亡的概念和生物学意义
一、细胞凋亡的概念
细胞凋亡一词源于古希腊语,本意指花 瓣或树叶从花或树上掉落或凋落(dropping off , falling off), Kerr借用它来形象地描述其死亡。 它是特殊的细胞死亡方式,是在基因控制下的主 动死亡,与坏死不同。
细胞凋亡有生理性的,也有非生理性的。
细胞的生理性死亡称为“程序性细胞
死”(programmed cell death, PCD)。程序性死
细 胞 凋 亡 (apoptosis) 一 词 是 由 Kerr 等 于 1972 年 首 先 提 出 , 至 80 年 代 末 , 通 过 Wyllie 、 Horvitz、Vaux等人的工作,表明细胞凋亡是细 胞生物体内普遍存在的现象,具有十分重要的生 理和病理学意义,此时人们才开始认识到Kerr的 发现及其观点的重要性,细胞凋亡的概念也因此 得到普遍的承认。
切核酸酶将DNA链在核小体之间的连接处切成缺 口,使核内DNA断成片段, 进一步切成180~200bp 的核酸片段,在琼脂凝胶电泳上呈现典型的梯形图 (typical ladder pattern)。坏死时DNA被随机降解,电 泳上不呈梯状图谱,经电泳后只能见一斑点。
⑤ 凋亡时细胞内容物不外溢,不影响局部
降,另一方面又可加速细胞凋亡的DNA降解与
断裂。
四、多聚腺昔二磷酸聚合酶
多聚腺昔二磷酸聚合酶(poly-ADP-ribosepolymerase, PARP)是存在于多数真核细胞中的 一个蛋白质翻译后修饰酶。PARP可能是许多 细胞如胸腺细胞、HL60细胞、乳腺癌细胞系等 细胞凋亡过程中caspases最富特征性的蛋白裂 解产物。
前体可活化蛋白酶激发因子,后者又可活化蛋白酶效
应因子(effector of caspase),然后作用于底物蛋白,如
核层蛋白(为核膜的结构蛋白,lamin)、多聚ADP-核
糖聚合酶DNA碎裂因子(DFF-45)等,蛋白分解而引起 细胞凋亡。
三、蛋白激酶
蛋白激酶(protein kinase, PK)是一类催化 蛋白质磷酸化的酶,故凡催化蛋白质进行磷酸化 修饰的酶,皆属于蛋白激酶,体内蛋白激酶的种 类很多,本节择其与细胞凋亡发生关系密切者— —蛋白激酶C (PKC)和DNA-PK介绍如下:
细胞凋亡异常增加,不该死的细胞死了, 可能与老年性痴呆、帕金森症、肌萎缩侧索 硬化症、心肌缺血/再灌注损伤有关。
如正常的细胞凋亡被抑制,该“死”的细胞不
死,可能是各种癌症和自身免疫性疾病的重要发
病机制。
第二节 细胞凋亡的形态变化
一、细胞凋亡形态变化的过程
早期细胞体积逐渐缩小,核染色质广泛凝
聚,而胞质内线粒体和其他各种细胞器的结构
Caspase家族具有蛋白酶的生物学特性。 目 前 已 发 现 该 蛋 白 家 族 至 少 有 14 个 成 员 , 即 Caspase1~14。Caspases在细胞凋亡发生中所起 的作用主要是 ： ①灭活细胞凋亡的抑制物,如Bcl-2;
②水解细胞的蛋白质结构,导致细胞解体,
形成凋亡小体
③ 在Caspases级联反应(caspase cascade)中水解 相关活性蛋白酶,导致细胞损伤。 例如,外界信号作用于caspase前体(procaspase),
呈一空晕。凋亡小体经常以单个结构而存在,少
数见到凋亡小体成簇存在于切片内。细胞凋亡 过程中不发生细胞内容物外溢,不造成局部微环 境改变,所以局部无炎症反应,不会发生继发性 组织损伤或病变。
三、电镜观察
早期可见细胞连接和特化的质膜结构(如
微绒毛)的消失,核染色质凝聚沿着核膜排列,形
成不同形状和大小的团块或呈新月形,并常将核
保持完好。死亡过程进一步发展,细胞表面形
成一些细胞突起,进而裂解为一些有生物膜包 绕的碎块(凋亡小体),并可被邻近的吞噬细胞 及其他细胞如上皮细胞、内皮细胞、成纤维细 胞乃至肿瘤细胞等所吞噬、分解而消失。
二、光镜观察
凋亡细胞或凋落小体在HE染色的切片中
有时可以见到,如核染色质浓缩成团块,胞质嗜
酸性;或仅有浓缩的染色质片段,周围无胞质,或
①坏死为病理性,首先是细胞膜受损伤、膜
通透性增加,特别是线粒体膜的结构、流动性、
渗透性以及受体等损伤至不可恢复时,细胞溶解 而死亡；凋亡则为生理性或病理性,细胞的结构 和某些功能仍保持完整。
②坏死时细胞的ATP和蛋白的 合成均明显被抑制或中止；凋亡时 ATP和某些mRNA和蛋白质的合成 仍进行活动。
酸酶的激活与调节细胞内信号传导机制有密切 关系。
细胞凋亡时核内的内切核酸酶活化,活化了 的 内 切 核 酸 酶 将 DNA 链 在 核 小 体 连 接 区 （ linker region ） 切 成 缺 口 (nick), 形 成 若 干
180~200bp或其倍数的寡核苷酸片段,在琼脂糖
凝胶电泳上呈“阶梯状”(ladder pattern)图谱。
(一)蛋白激酶C
蛋白激酶C (PKC)是以其活性依赖于Ca2+ 而得名。此酶在血小板、脾、脑等组织中含量 丰富,可作用于多种底物蛋白,改变其酶的活性 或蛋白功能,其活性能被甘油二酯(DAG)加强。 PKC的作用主要是促进细胞的增殖和分化,抑制 细胞凋亡,但也可促进细胞凋亡。
例如佛波豆冠乙酯(PMA)PKC活化剂可阻 断由糖皮质激素诱导的胸腺细胞凋亡的发生； PMA亦可抑制依赖IL-3的小鼠骨髓细胞及肝细 胞凋亡;PMA还可直接阻断Ca2+诱导的胸腺细胞 核小体之间DNA的断裂和片段化过程。
继而细胞膜内陷将细胞分割形成外有膜 包绕的细胞质团块,其中含有核染色质碎块及细 胞器成分不等,即凋亡小体(apoptoticbody)。 凋
亡小体大小不一,大致呈球形或椭圆形,其周围
有时可见一亮晕。最小者仅为质膜包绕的电子 密度高的物质,或含有一些核糖体。
最后凋亡小体被邻近吞噬细胞或正常组织 细胞吞噬。凋亡小体被吞噬后,最初仍可保持其
目前认为在DNA损伤时可激活多聚腺昔