操作时注意两点：一是将载体有关基团活化，然后 与酶有关基团发生偶联反应；另一种是在载体上接 上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。 主要有重氮法、溴化氰法和烷化法等。
优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度 优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度 高或存在盐类等原因而轻易脱落，可连续使用较 长时间。 缺点：反应条件苛刻，操作复杂；且由于采用了 缺点：反应条件苛刻，操作复杂；且由于采用了 比较激烈的反应条件，可能影响酶的空间构象而 影响酶的活性。会引起酶蛋白高级结构变化，破 坏部分活性中心，因此往往不能得到比活高的固 定化酶，酶活回收率一般为30％左右，甚至底物 定化酶，酶活回收率一般为30％左右，甚至底物 专一性等酶的性质也会发生变化。
（2）半透膜包埋法 将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小 球内，制成固定化酶。 通常直径为几微米到几百微米的球状体， 颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物 和产物扩散，但是反应条件要求高，制备 成本也高，适用于底物和产物都是小分子 物质的酶的固定化。 方法：界面沉淀法、界面聚合法、二级乳 化法、脂质体包埋法、多电能试剂使酶与酶之间发生交联作用，制 成网状结构的固定化酶的方法 。 此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶，所不同 的是它不使用载体。 参与交联反应的酶蛋白的功能团有N末端的α 参与交联反应的酶蛋白的功能团有N末端的α-氨基、赖氨 酸的ε 酸的ε-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巯基和组氨酸 的咪唑基等。作为交联剂的有形成希夫碱的戊二醛，形 成肽键的异氰酸酯，发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺 等。最常用的交联剂是戊二醛。 优点：酶结合牢固，可长时间使用。 优点：酶结合牢固，可长时间使用。 缺点：反应条件比较激烈，酶分子的多 缺点：反应条件比较激烈，酶分子的多 个基团被交联，酶活力损失较大，制成 的固定化酶的颗粒较小，使用不便。
利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生 聚合的原理包埋酶。例如，将含10％血红 聚合的原理包埋酶。例如，将含10％血红 蛋白的酶溶液与1 蛋白的酶溶液与1，6-己二胺的水溶液混 合，立即在含1 span-85的氯仿－环乙烷 合，立即在含1％span-85的氯仿－环乙烷 中分散乳化，加入溶于有机相的癸二酰氯 后，便在油后，便在油-水界面上发生聚合反应，形成 半透膜，将酶包埋。
第二节 细胞固定化
采用物理或化学方法固定化细胞，是利用酶或 酶系的一条捷径。 固定化细胞的分类：
分类方式 细胞类型 固定化细胞 微生物 植物 动物 分类方式 固定化细胞 生理状态 死细胞:完整细胞,细胞碎片, 死细胞:完整细胞,细胞碎片, 细胞器 活细胞:增殖细胞,静止细胞, 活细胞:增殖细胞,静止细胞, 饥饿细胞
3、固定化酶的最适pH变化 、固定化酶的最适pH变化
原因可能是： （1）载体性质对最适pH值的影响（微环境表面 ）载体性质对最适pH值的影响（微环境表面 电荷的影响）：一般说来，带负电荷载体（阴离 电荷的影响）：一般说来，带负电荷载体（阴离 子聚合物）制备的固定化酶，其最适pH值较游 子聚合物）制备的固定化酶，其最适pH值较游 离酶偏高，这是因为多聚阴离子载体会吸引溶液 中阳离子，包括H 中阳离子，包括H+，使其附着于载体表面，结果 使固定化酶扩散层H 使固定化酶扩散层H+浓度比周围的外部溶液高， 即偏酸，这样外部溶液中的pH值必须向碱性偏 即偏酸，这样外部溶液中的pH值必须向碱性偏 移，才能抵消微环境作用，使其可表现酶的最大 活力。反之，使用带正电荷的载体其最适pH值 活力。反之，使用带正电荷的载体其最适pH值 向酸性偏移。
2、包埋法
将酶包埋在高聚物凝胶网格中或高分于半透膜 内的固定方法；前者又称为凝胶包埋法，后者 则称为微囊法。 分为凝胶包埋和半透膜包埋两种（也称网格型 和微囊型）
（1）凝胶包埋法： 将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制 成一定形状的固定化酶或固定化菌体。 载体材料有聚丙稀酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合 成高分子化合物以及淀粉、明胶、海藻酸等天然高 分子化合物。 合成高分子化合物常采用单体或预聚物在酶或微生 物存在下聚合的方法，而溶胶状天然高分子化合物 则在酶或微生物存在下凝胶化。 优点：操作简便 缺点：不适于底物或产物分子很大的酶类的固定化
第一节 酶的固定化
固定化酶是20世纪50年代开始发展起来的一项新技术 固定化酶是20世纪50年代开始发展起来的一项新技术 “水不溶酶（Water Insoluble Enzyme）”和“固相 水不溶酶（Water Enzyme） 酶（Solid 酶（Solid Phase Enzyme）”：将水溶性酶与不溶性 Enzyme） 载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物。 “固定化酶(Immobilized Enzyme)” ： 固定化酶(Immobilized Enzyme)” 将酶包埋在凝胶内或超滤装置中，高分子底物与酶在 超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出，酶本身仍 处于溶解状态，只不过被固定在一个有限的空间内不 能自由流动。在1971年第一届国际酶工程会议上，正 能自由流动。在1971年第一届国际酶工程会议上，正 式建议采用“固定化酶” 式建议采用“固定化酶”。
固定化酶的优缺点
优点： 1.可多次使用，且酶的稳定性提高。 可多次使用，且酶的稳定性提高。 2.反应后，酶易与底物和产物分开。 反应后，酶易与底物和产物分开。 3.反应条件易于控制 。 缺点： 1.费用太高。 1.费用太高。 2. 大分子的底物不易使用。 3、固定化时，酶活力有损失 。
固定化酶方法的优缺点比较
为适应工业化生产的需要，模仿人体酶的作用方 式，通过固定化技术对酶加以改造固定。 经固定化后的生物催化剂既具有酶的催化性质， 又具有一般化学催化剂能回收反复使用的优点， 并在生产工艺上可以实现连续化和自动化。 随着固定化技术的发展，定化的对象已不一定是 酶，亦可以是微生物或动植物细胞和各种细胞器， 这些固形物可统称为生物催化剂。
第五章 生物催化剂的固定化
酶固定化的制备原则 *酶固定化的（载体结合法、包埋法、 交联法）及各自的优缺点 *固定化酶的性质及其影响原因 固定化细胞和固定化原生质体 固定化酶、固定化细胞、固定化原生 质体的优缺点 *评价固定化酶（细胞）的指标
酶的应用的不足之处 （1）酶的稳定性较差：在温度、pH值和无 ）酶的稳定性较差：在温度、pH值和无 机离子等外界因素的影响下，容易变性失活。 （2）酶的一次性使用：酶一般都是在水溶液 ）酶的一次性使用：酶一般都是在水溶液 中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底 物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍 有较高的活力，也难于回收利用。 （3）产物的分离纯化较困难：酶反应后成为 ）产物的分离纯化较困难：酶反应后成为 杂质与产物混在一起。
（2）共价结合法 共价结合法是通过酶分子上的功能团，与 载体表面上的反应基团发生化学反应形成 共价键的一种固定化方法。 载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚 糖凝胶、甲壳素等 可与载体结合的酶的功能团有氨基、羧基、 巯基、羟基、酚基和咪唑基等。但参与共 价结合的氨基酸残基应当不是酶催化活性 所必需的，否则往往造成固定后的酶活完 全丧失。
（2）扩散效应的影响：由于H+由反应液向固定 ）扩散效应的影响：由于H 化载体内部扩散受到一定的扩散阻力，固定化酶 内部反应区域的H 内部反应区域的H+一般比反应液中的低，因此必 须提高周围反应液的pH，才能达到反应羧要求的 须提高周围反应液的pH，才能达到反应羧要求的 最适pH。因此，固定化酶的最适pH显得比游离 最适pH。因此，固定化酶的最适pH显得比游离 酶要低一些（偏酸）。 （3）产物性质的影响：但产物为酸性时，由于 扩散受到限制而积累在固定化酶所处的催化区域 内，使此区域内的pH降低，必须提高周围反应液 内，使此区域内的pH降低，必须提高周围反应液 的pH，才能达到酶所要求的pH值。因此，固定 pH，才能达到酶所要求的pH值。因此，固定 化酶的最适pH值比游离酶要高些。反之，则低。 化酶的最适pH值比游离酶要高些。反之，则低。 中性产物，对其影响不大。
二、固定化酶的性质
1、固定化后酶活力的变化
多数情况下比天然酶小，原因可能是： （1）酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化， 甚至影响了活性中心的氨基酸； （2）固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间 位阻），会直接影响到活性中心对底物的定位作用； （3）内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻； （4）包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底 物不能透过膜与酶接近。
4、固定化酶的最适温度变化 酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应 速度的综合结果。由于固定化后，酶的 热稳定性提高，所以最适温度也随之提 高。
5、固定化酶的底物特异性变化
固定化底物特异性的变化与底物分子质 量的大小有一定关系，原因是：由于载 体的空间位阻作用引起的。 大分子底物，难以接近酶分子 小分子底物，不受影响
3、结合法
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起 的固定化方法。 （1）离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性的载体。 常用载体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂。 如，DEAE如，DEAE-纤维素、 DEAE- 葡聚糖凝胶）。 DEAE优点：操作简单，处理条件温和，酶的高 优点：操作简单，处理条件温和，酶的高 级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破 坏，能得到酶活力较高的固定化酶。 缺点：载体和酶的结合力比较弱，容易受 缺点：载体和酶的结合力比较弱，容易受 缓冲液种类或pH的影响，在离子强度高的 缓冲液种类或pH的影响，在离子强度高的 条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱 落。（但比物理吸附作用力强）
二、酶的固定化方法
1、物理吸附法 2、包埋法 3、结合法 （1）离子结合法 （2）共价结合法 4、交联法
1、物理吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表 面上而使酶固定化的方法称为物理吸附法。 载体：无机载体有活性炭、多孔玻璃、硅藻土等； 天然高分子载体有淀粉等。 优点：物理吸附法具有操作简便，条件温和，酶 优点：物理吸附法具有操作简便，条件温和，酶 活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少，载体 价廉易得，且可反复使用； 缺点：但由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶 缺点：但由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶 与载体结合不牢固而容易脱落。