华中农业大学本科课程考试评分标准考试课程与试卷类型：基因操作原理姓名：学年学期：学号：考试时间：班级：一、填空题（每小题2分，共30分）1.PCR技术应用广泛，以下不属于PCR应用的为 ___D_____：(A) 随机扩增多态性DNA(RAPD)； (B) 扩增片段长度多态性(AFLP)； (C) RACE； (D) S1 酶作图。

2.λ噬菌体线性 DNA 分子的两端各有一个____12_____个碱基组成的天然黏性末端。

3.PCR扩增有时会出现弥散的条带，以下原因阐述不正确的是___B______：(A) 退火温度过低； (B) 退火温度过高； (C) dNTP 浓度过高； (D) 循环次数过多。

4.下列哪一种酶作用时需要引物____B_____：(A) 末端转移酶； (B) 反转录酶；(C) DNA连接酶； (D) 限制酶。

5.Cosmid 实际上是由_λ噬菌体__和__质粒_____构成的杂合载体，也可以说是带有__cos__序列的质粒。

6.限制性内切酶的命名主要根据__来源菌株属名第一个字母，种名头两个字母以及菌株号、序号_____来确定，以下各种书写方式中哪种或哪几种是正确的____AC____：(A) Pst I;(B) KpnI； (C) Hin dIII; (D) Hind III; (E) T th111I; (F) Bsp1286I； (G) XbaI7.在分子克隆常用的E.coli菌株中Dam 和Dcm 甲基化酶都是有活性的，它们可在DNA的特定位点作甲基化修饰。

而许多限制性内切酶对甲基化是敏感的，一旦所识别的酶切位点被甲基化就不能切割该位点，如Cla I (AT/CGAT)。

请问Cla I不能切割以下哪个或哪些来自dam+ dcm+ E.coli菌株的DNA序列____C_____。

(A) ATCGATA； (B) ATCGATG；(C) ATCGATC； (D) ATCGATT。

8.限制性内切酶有其特定的识别位点，如Eco RI 的识别位点为 ___GAATTC___；有些限制性内切酶切割DNA后可产生带有相同末端的DNA产物，这些酶称为同尾酶，例如__Bam HI__限制性内切酶与___Sau3AI_________限制性内切酶切割DNA形成的末端相同。

（任举一例都可以）9.在基因操作过程中会使用一些多对人体有害的物质, 操作时应小心谨慎, 常用的有害物质有UV light、DEPC、____EB___和____苯酚____等。

（任举一例都可以）10.根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。

在下列文库中_C_是cDNA文库。

(A) YAC文库； (B) PAC文库； (C) 扣减文库； (D) BAC文库。

11.M13KO7是一种辅助噬菌体，可用它帮助噬菌粒制备单链DNA，这是因为以下原因_B_：(A) M13KO7能够进行滚环复制，得到大量的单链噬菌体DNA； (B) M13KO7能够提供成熟包装的蛋白； (C) M13KO7提供了成熟包装所需的信号； (D) M13KO7的10个基因都是正常的。

12.在制作DNA嵌套缺失突变体时主要有3种方法，其核心技术都使用了一种核酸酶，它们分别是__外切核酸酶III__、__BAL31__和___DNaseI___。

13.在核酸杂交过程中，一般都要先做预杂交，这是为了__B__：(A) 做预备试验，寻找最佳反应条件； (B) 封闭背景； (C) 使杂交信号更强； (D) 减少非特异性杂交信号。

14.在许多克隆载体中都使用了 -互补机制来做筛选标记，也就是俗称的“蓝白菌落”筛选，在应用过程中使用了两种引起颜色变化的试剂，它们是___x-gal__和____IPTG__。

15.在基因操作中有些不同的名称具有相同的缩写，例如RT-PCR, 可以是___实时定量PCR__或___反转录PCR___的缩写。

二、名词解释（每小题3分，共21分）1．Star Activity (in restriction enzymes)星星活性，（1’）极端非标准条件下，限制性内切酶切割与识别序列相似的序列，这个改变的俄特殊性称星星活性。

（2’）2．Northern blottingNorthern 杂交，（1’）即DNA与RNA的杂交，与Northern杂交的不同之处在于转移的是RNA而不是DNA。

（1’）Northern 杂交是转录水平的检测，用于检测样品中是否有与探针同源的mRNA分子。

（1’）3．Shuttle vector穿梭载体，（1’）能够在两类不同的宿主中复制、选择和增殖的载体。

（2’）4．Chromosome Walking染色体步查，（1’）采用一段分离自某一重组体一端的非重复DNA片段作为探针，以鉴定含有相邻序列的重组克隆的方法称染色体步查。

（2’）5．Klenow fragmentKlenow片段，（1’）大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶水解的大片段。

（1’）具有5’—3’聚合和3’—5’外切活性。

（1’）6．Universal primer通用引物，（1’）参照载体上多克隆位点两侧的一段固定DNA序列设计的引物，（1’）用于分析插入片段的序列。

（1’）7．Competent cells感受态细胞，（1’）能够吸收外源DNA的细胞称作感受态细胞。

（2’）三、分析简答题（每小题5分，共25分）1. 人类基因组的大小约为3000Mb，测序方法有两种，即图谱测序法和全基因组鸟枪法。

这两种测序结果和分析于2001年分别发表在《Nature》和《Science》杂志上。

在第一种方法中，首先将靶基因组部分酶切产生大分子DNA片段，经电泳分离纯化克隆到BAC载体中。

根据分子标记和指纹图谱构建BAC克隆重叠群，挑选单个克隆采取鸟枪法测序。

在每个BAC克隆内根据测序结果进行顺序拼接，并与BAC克隆重叠群物理图谱对比，完成全部主体顺序的组装(The International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 2001, 409: 860~921)。

假如你是测序工作组中的一员，由你负责某个BAC克隆子中约100kb的序列测定，该如何实施？①分离纯化该质粒，构建外源DNA片段大小2-5kb的亚文库。

（1’）②用构建亚文库的载体上的通用引物作大规模末端测序。

（1’）③测序的各reads 拼接，得到contig。

（1’）④借助PCR等手段，填补contig中的gap。

（1’）⑤通过酶切图谱验证测序结果。

（1’）体是常用的一种。

A/T载体也有多种工作方式，下图是pCR2.1-TOPO 载体的核心工作原理示意图。

请说出A/T载体克隆PCR产物的一般原理，以及pCR2.1-TOPO 载体所拥有的特殊工作方式。

①用不具有3’-5’外切活性的高温DNA polymerase（如Taq）作PCR扩增时，其产物3’多一个碱基A。

（1’）②在A/T载体的3’未端各有一个突出的碱基T，用于和A配对，从而克隆Taq polymerase的PCR产物。

（2’）③Topoisomerase第274位的酪氨酸与DNA 5’端磷酸之间形成的磷酸二酯键是不稳定的，容易受到DNA 3’羟基的攻击。

TOPO 载体利用其末端自身携带的Topoisomerase形成磷脂键，不需要外加连接酶。

（2’）3. 从苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种YBT-1765中克隆得到一个质粒pBMB175，选用限制性内切酶Cla I和Xba I对该质粒进行酶切分析，得到以下如表所示的结果。

请根据所得的酶切片段大小，标出Cla I酶切位点在质粒pBMB175上的位置。

Xba限制片段的大小（kb）片段序号ClaⅠ XbaⅠ Cla I+Xba I1 11.0 8.8 7.62 4.2 5.4 3.03 1.0 2.44 1.25 1.0总计15.2 15.2 15.23.0kb 和14.0 kb ，答对一处给2分4．许多限制性内切酶切割DNA 后可产生相同的突出末端，这些产物彼此之间可进行粘端连接。

但在连接产物中相应位置的酶切位点就不存在了。

例如某DNA 片段用Cla I (AT/CGAT)酶切后，可与Acc I (GT/CGAC)切割的载体连接，但在连接点处的Cla I 和Acc I 位点都消失了，相应的序列变成了ATCGAC 。

下图最上面的序列为Cla I/ Acc I 连接处的DNA 序列。

通过这些步骤可在连接点处恢复Cla I 位点，请指出每一步所用的关键酶和底物。

1.Sph I2.Klenow （或T 4 T 7 polymerase ）3.过量dATP4.S1酶（或绿豆核酸酶）5.ligase 每空一分Recovering Cla I--ATCGACAAGCTT----TAGCTGGCC AA----ATCGA TT-- --TAGCT AA----ATCGATT-- --TAGCTAA----ATCGA CCGGCATGCAAGCTT----TAGCT GGCCGTACGTTCGAA----ATCGACCGGCATG CAAGCTT----TAGCTGGCC GTACGTTCGAA--D ( 5 )C ( 4 )B ( 2 ， 3 )A( 1 )5. 用于cDNA 克隆的方法很多,下图是 SMART 技术构建全长cDNA 文库的基本原理流程图。

请叙述其核心步骤。

①polyT 引物合成cDNA 第一链，反转录酶具有末端转移酶活性，自动在产物末端加上几个d （C ）。

（2’）②反转录过程中同时添加了带有3个d （G ）的引物，以该引物合成第一链的互补链，锚定全长cDNA 。

（2’）③引物延伸或长距离PCR 得到双链cDNA 。

（1’）四、问答题 （每小题8分，共24分）1. 通过生物测定，发现一种真菌具有抗某种细菌的抗菌活性。

通过生物化学的方法从该真菌中分离到一个具有抗细菌活性的蛋白质，该蛋白表现出良好的开发成蛋白药物的潜力。

若要在E.coli 或酵母菌中大量表达并制备该抗菌蛋白质，试问如何分离得到该蛋白的编码基因。

①测定该蛋白质的N 未端氨基酸序列（1’）②根据氨基酸序列设计简并引物，用作基因克隆的探针（2’） ③构建真菌的cDNA 文库（2’）④用探针作Southern 杂交，从文库中筛选含该基因的重组子（2’） ⑤重组子的纯化、验证测序（1’）①中如果是制备该蛋白的抗体③构建表达文库，从中筛选则该题亦可给分。

2. 魔芋 (Amorphophallus ) 是单子叶植物纲 (Monocotyledoeae )、泽泻目 (Alismatales )、天南星科 (Areaceae ) 的多年生草本块茎植物。