单克隆抗体(单抗)：可无限大量的得到针对单一决定簇 的抗体，缺点是结合的单一性。当建立双抗夹心ELISA 测定方法时，如包被和指示抗体使用同一单抗，则由于 结合位点的缺乏，很容易造成假阴性结果，尤其是在使 用一步法时“钩状”效应(Hookeffect)的出现。因此， 在使用单抗建立双抗夹心ELISA方法时，包被和指示抗 体常使用针对抗原的不同决定簇的单抗，包被抗体可为 混合单抗，从而使得固相抗体在免疫测定中能更为完全 地结合待测物中的特异抗原。
F半乳糖甘酶
影响试剂盒质量的因素
(5)色原底物：HRP最常用的色原底物有邻苯二胺 (OPD)和四甲基联苯胺(TMB) 。
邻苯二胺(OPD)：OPD被认为是HRP最为敏感的色原底 物之一，当pH值降为1.0时，最大吸收波长为492nm， 显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。 OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。
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+/-
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34 + +++ ++++
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36 + +++ ++++
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ELISA试剂盒的质检-抗HCV
编号 结果 确认结果
编号 结果 确认结果
NS4 NS3 C
NS5
NS4 NS3 C
NS5
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+/- ++
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试剂盒的选用
1．根据可能影响试剂盒质量的因素，从以下几 个方面来判断该试剂盒是否符合我们的要求
效期
固相材料的来源
包被抗体或抗原的性质(单抗、多抗或合成多 肽或重组多肽)
显色底物(是TMB还是OPD) 测定模式(一步法或二步法)
试剂盒的选用
2．同行对有关试剂盒的使用效果
个别的使用效果
在实际工作中，其它实验室对某种试剂盒的实际 使用效果，往往具有很强的说服力。
+
ELISA试剂盒的质检
3.采用弱阳性定值质控血清进行质检
对不同厂家或同一厂家不同批号试剂盒采用同 一弱阳性定值质控血清检测，可比较出不同厂 家或不同批号试剂盒的检测灵敏度(测定下限) 的差异，对判断试剂盒的质量及其稳定性具有 重要的参考价值。
影响试剂盒质量的因素
2．试剂盒的方法学设计 双抗原夹心法测抗体(抗HIV、Tp)
待测 抗体
酶标
抗原
E
E
E
底物 显色
E
E
固相 抗原
洗板
洗板
E
E
E
温育
E
影响试剂盒质量的因素
间接法测抗体（抗HCV、Tp)
待测 抗体
酶标
E
E
E
抗体
底物 显色
E
E
固相 抗原
洗板
洗板
E
E
E
温育
E
影响试剂盒质量的因素
双抗体夹心法测抗原-两步法
立体结构：合成抗原一般都是多肽抗原，缺乏完 整抗原所具有的立体结构决定簇，用于相应的 抗HCV和抗HIV抗体的检测有可能导致结合上 述决定簇的抗体漏检。
影响试剂盒质量的因素
(3)抗体
多克隆抗体(多抗)：制备简单，含针对抗原的多种决定 簇，但抗体的亲和力和特异性相对要低于单抗，且每次 制备的抗体在其亲和力和特异性上均有区别。
待测 抗原
固相 抗体
酶标
E
抗体
E
E
温育
E
E
E
底物 显色
温育
E
E
E
影响试剂盒质量的因素
双抗体夹心法测抗原-一步法
待测 抗原
酶标
E
抗体
E
E
底物 显色
固相 抗体
E
E
E
洗板
温育
E
E
E
E
E
E
E
影响试剂盒质量的因素
3．试剂盒的运输和贮存
ELISA试剂盒的效期一般为6个月，这是指 在贮存温度为2～8ºC的情况下，但一个 试剂盒从出厂至用户手中，均要经历运 输(如送检、检定、发货等)及运输中的贮 存，某一环节的不当，均会影响试剂盒 的临床使用质量。
26 + ++++ ++++ ++++ +++ 39 + ++++ +++ ++ +
27 +
++++
40 + ++ +++ ++++ +
28 + +++ +++++ ++++ ++++
29 + +++ ++++ ++++ ++++ຫໍສະໝຸດ ELISA试剂盒的质检-TP
样本 初 筛 确 认 编号 (RPR/TRUST) (EIA/TPPA)
影响试剂盒质量的因素
(4)酶结合物 ELISA试剂盒的核心部分，通常 ELISA试剂盒的有效使用期限即是根据酶结合 物的稳定性而定的。
辣根过氧化物酶(HRP)：易于提取，价格相对 低廉；性质稳定，耐热及有机溶剂的作用，与 抗原或抗体偶联后，活性很少受损失。
碱性磷酸酶(ALP)：碱性磷酸酶用于ELISA必须 注意的是含磷酸盐的缓冲液对其酶活性的抑制 作用
ELISA试剂盒
影响试剂盒质量的因素 试剂盒的选用 试剂盒的质检方法 目前试剂盒存在的问题
影响试剂盒质量的因素
1．原材料
(1)固相材料 商品ELISA试剂盒中基本上都使用 聚苯烯塑料微孔板，其对ELISA试剂盒的影响 在于孔间的显色差异。
(2)抗原 --自然抗原、合成抗原和基因重组抗原。
纯 度：纯度不高可致试剂盒的特异性不强。
四甲基联苯胺(TMB)：氧化产物联苯醌在波长450nm处 有最大消光系数。试剂盒中常为已配好的A、B两种液 态试剂，即一定浓度双氧水溶液和TMB。它们在溶液 中相对不稳定，因此在使用ELISA试剂盒时，如底物 A·或／和B出现颜色，或各取一滴混合后显色，说明该 试剂盒的底物溶液已变质或已受污染，必须废弃。 ·
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样本 初 筛 确 认 编号 (RPR/TRUST) (EIA/TPPA)
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综合的使用评价
对一种试剂盒的综合使用评价，是指多个实验室 对这种试盒实际应用效果的综合分析。
ELISA试剂盒的质检
1.包装、储存状态 内外包装、效期、试剂瓶是否漏液，真空包装 是否破损，试剂是否齐全等等
2.采用血清盘(panel)质检 血清盘由一定数量的阴、阳性样本组成，可用 来判断试剂盒的灵敏度、特异性和符合率，如 HBsAg、抗HCV和抗HIV等血清盘。