分离方法
分离法
色谱分离法 电泳分离法
气相色谱法 液相色谱法 超临界流体色谱法
毛细管电泳法 毛细管电动色谱法
第十三章 色谱法分离原理
第一节 概述
1903年俄国植物学家茨维特在研究植物叶的色素成 分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻 璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中 各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法 因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的 分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人 们沿用至今。
• 平板色谱简单、方便、及操作费用低， • 可以在一块层析板上同时展开多个试样及 将多条滤纸同时展开。 • 采用方形薄层板还可以方便的进行二维展 开，即按一般方法展开后，改变方向和展开 剂再次展开，进一步改善分离效果。 • 试样一般不需要经过预处理即可分离。
缺点:
• 缺点： 分离效率较低，不适用挥发性 试样分离。定性定量不便。 • 应用：平板色谱法在染料、农药、医药 、有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基 酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离分 析中经常被使用。也可以用于无机离子的 分离。还经常作为高效液相色谱的一种预 试方法。
第三节 色谱法基本原理
下图是 A、B两组分沿色谱柱移动时， 不同位置处的浓度轮廓。
AB
浓 度
A
B
沿柱移动距离 L
图中KA>KB ，A组分在移动过程中滞后。
随着两组分在色谱柱中移动距离的增加， 两峰间的距离逐渐变大，同时，每一组分 的浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢变宽。 显然，区域扩宽对分离是不利的，但又是 不可避免的。
4、按照展开程序分类
洗脱法、顶替法、和迎头法。
洗脱法也称冲洗法。先将样品加到色谱柱头上， 然后用吸附或溶解能力比试样组分弱的气体或液体 作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能 力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使 组分彼此分离。这种方法能使样品的各组分获得良 好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可 获得纯度较高的物质。
➢ 固定相——CaCO3颗粒 ➢ 流动相——石油醚
色带
叶绿素色谱分离.swf
填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固 体或液体）称为固定相；
自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称 为流动相；
装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为 色谱柱。
色谱柱内分析过程.swf
1、按流动相的状态不同分为两类： (1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）。 按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱； 按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱
u L tM
2．保留时间tR （保留体积 VR ）
试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经 历的时间，称为保留时间，如图 O′B。它相 应于样品到达柱末端的检测器所需的时间。
3．调整保留时间tR′（调整保留体积VR′） 某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调
整保留时间。
即 tR′= tR - tM 由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随 流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留
A A+ B
色谱法的特点
✓ 优点：“三高”、“一快”、 “高一选广择”性——可将性质相似的组分分开 高效能——反复多次利用组分性质的差异产生 很好分离效果 高灵敏度——10-11~10-13g，适于痕量分析 分析速度快——几~几十分钟完成分离一次可以 测多种样品 应用范围广——气体，液体、固体物质化学衍 生化再色谱分离、分析
分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的
K或k值相差越大，则分离得越好。
两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先 决条件。
从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：
（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含 组份的最少个数； （2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进 行定性分析；
(3) 根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定 量分析； （4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价 色谱柱分离效能的依据； （5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和 流动相)选择是否合适的依据。
例如，对填充柱，其β值一般为6～35；对毛细 管柱，其β值为60～600。
分配系数K及分配比k与选择因子的关系


tR ( B) tR( A)

k(B) k ( A)

K (B) K (A)
通过选择因子把实验测量值k与热力学性质 的分配系数K直接联系起来，对固定相的选择
具有实际意义。
如果两组分的K或k值相等，则=1，两个组
选择因子 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准 （s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值。
此时，γi/s可能大于1，也可能小于1。在多元混合物
分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的 相对保留值作为重要参数．在这种特殊情况下，可用 符号表示：

tR2 t R1
式中tR2′为后出峰的调整保留时间，总是大于1的。
3. 点样
用微量注射器或玻璃毛细管吸取一 定量试样点在原点上。试样点的直径 一 般 应 小 于 5mm 。 可 并 排 点 多 个 试 样同时展开。
4.显色、检测
有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅 笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显色剂、碘 蒸气熏或氨水熏等。
特点及应用
AB
浓 度
A
B
沿柱移动距离 L
若要使A、B组分完全分离，必须满足以 下三点：
一、两组分的分配系数必须有差异； 二、区域扩宽的速率应小于区域分离的 速度； 三、在保证快速分离的前提下，提供足 够长的色谱柱。
第一、二点是完全分离的必要条件。作为一 个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移 动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起 区域扩宽的各种因素。
操作技术
1.层析纸和层析板
特制的色层滤纸。按需要剪裁成长条形（或筒型）。层析板是 用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝，200～250 目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.15～0.5mm）。干燥 后即可使用。
2.展开剂
由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离 氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸： 水=4：1：1。
(2)液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。
(3)其它色谱方法 薄层色谱和纸色谱
凝胶色谱法：测聚合物分子 量分布。 超临界色谱: CO2流动相。 高效毛细管电泳: 九十年代快速发展、特别适 合生物试样分析分离的高效 分析仪器。
2、 按分离机理分类
吸附色谱法：利用组分在吸附剂（固定相） 上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法。
k ns csVs
nm
cmVm
tR tM (1 k)
k tR tM tR VR
tM
tM VM
分配系数K与分配比k的关系
K cs ns /Vs k • Vm k •
cm nm /Vm
Vs
其中β称为相比率，它是反映各种色谱柱型特谱：固定相装于柱内的色谱法 平板色谱：固定相呈平板状的色谱，它又 可分为薄层色谱和纸色谱。
纸层析和薄层层析分离过程
纸层析和薄层层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方 法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。
纸层析和薄层层析流 动相的移动是依靠毛细作 用。
将试样点在色谱滤纸或 层析板的一端，并将该端 浸在作为流动相的溶剂（ 常称之为展开剂）中，随 着溶剂向上的移动，经过 试样点时，带动试样向上 运动。
2.分配比 k
分配比又称容量因子，它是指在一定温度和 压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固 定相和流动相中的质量比。即
组分在固定相中的质量 k 组分在流动相中的质量
ms mm
k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当 于柱的容量大，又称分配容量或容量因子。它是衡量 色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定 于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变 化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。
五、区域宽度 色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的 函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色 谱峰区域宽度通常有三种方法：
1. 标准偏差σ 0．607倍峰高处色谱峰宽的一半，如图中EF距 离的一半。
2. 半峰宽Y1/2 峰高一半处对应的峰宽，如图中GH间的距离。 它与标准偏差σ的关系是：
Y1/2 = 2.354σ
3. 基线宽度Y 色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距， 如图中IJ的距离．它与标准偏差。的关系是：
Y = 4σ
六、分配系数K和分配比k
1 ．分配系数K 分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和 流动相之间反复多次的分配过程，而吸附色谱的 分离是基于反复多次的吸附-脱附过程。 分离过程经常用样品分子在两相间的分配来 描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K。
✓ 缺点： 对未知物分析的定性专属性差 需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)
第二节 色谱有关术语
一、色谱流出曲线和色谱峰 当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与 固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的 差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异， 不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先 后不同的次序从固定相中流出，由柱后检测器输 出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱
分配系数K是指在一定温度和压力下，组分在固定
相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即
溶质在固定相中的浓度 k 溶质在流动相中的浓度
cs cm
分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的， 它是每一个溶质的特征值，它仅与两个变量有关：固 定相和温度。与两相体积、柱管的特性以及所使用的 仪器无关。
A
B
顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相 中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组 分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动 相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力 的强弱顺序，依次顶替出固定相。吸附或溶解能 力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。