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转膜
转膜
转膜
转膜
转膜
转膜中的要点与建议
封闭
抗体孵育
抗体孵育
直接法与间接法的比较
直接法 快速（一种抗体）
间接法 额外的二抗孵育以及条件优化
没有二抗交叉反应引起的非特 交叉反应引起的非特异性条带 异性条带
无信号二级放大 免疫反应性降低
Western Blot基本原理及操作
中山医院临床医学研究院 侯嘉云
hou.jiayun@
Michael A. Milhollen, cancer research, 2011
流程
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
谢谢！
癌性，可通过皮肤吸收及呼吸道进入人体，其作用具有积累性。聚丙烯酰胺无毒， 但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分 • Bis （甲叉双丙烯酰胺）：有毒，影响中枢神经系统，切勿吸入粉末 • AP(过硫酸铵)：对黏膜和上呼吸道组织、眼睛和皮肤有极大危害性。吸入可致命 • TEMED：强神经毒性，防止误吸，操作时快速，存放时密封 • NaN3 (叠氮钠)：毒性非常大，阻断细胞色素电子运送系统
从而电泳时易烧胶 • 保持所有装置清洁； • 试剂要有正确的pH值，及妥当的保存
凝胶电泳
Staking gel Separating gel
小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥； 浓缩胶 80v左右，分离胶100v左右
上样的注意要： • 20--50ug总蛋白 或100ng纯蛋白， 可根据蛋白 表达水 平进行优化； • 尽量保持每个泳 道的蛋白量一样， 体积尽量一致； • 样品两侧的及空 置的泳道用等体积 的1×loading buffer上样
• Triton X-100：引起严重的眼睛刺激和灼伤，可因吸入、咽下或皮肤吸收而受害 • SDS (十二烷基硫酸钠)：有毒，是一种刺激物，并造成对眼睛的严重损伤的危险 • DTT （二硫苏糖醇）：很强的还原剂，散发难闻的气味，可因吸入、咽下或皮肤吸
收而危害健康，由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差 • Acr（丙烯酰胺）：具有很强的神经毒性，同时还有生殖、发育毒性，可能具有致
信号放大灵敏度高（多个二抗 结合位点）
免疫特异性不受标记影响
对照
内参的选择
• 目的蛋白分子量 相差5KD以上
• 实际的试验环境 组织缺氧、糖尿病： GAPDH升高 凋亡及移除核膜： Lamin 骨骼肌：beta-actin
检测方法
常见问题-信号弱或无信号
常见问题-高背景
常见散
常见问题-条带弯曲
常见问题-其他
安全注意事项
原则 操作有毒试剂，带口罩和手套 操作挥发性试剂应在通风橱中进行
安全注意事项
• PMSF：苯甲基磺酰氟是一种高强度毒性的胆碱酯酶抑制剂，它对呼吸道黏膜、眼 睛和皮肤有非常大的破坏性，可因吸入、咽下或皮肤吸收而致命
蛋白定量
蛋白定量
• 简介 以医院logo颜色为整体色系，总体以简洁、
突出ppt展现内容为主。
• 简介
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样品准备
样品制备过程中的一些要点与建议
• 收集细胞离心时转速需适当； • 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子； • 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的对蛋白 修饰的改变，制备过程应在低温进行； • 样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直 接以液体状态置 -80℃中保存，但要注意不要反 复冻； • 煮样时防止爆管
分离胶凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶制备-分离胶
灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
浓缩胶(5%)
凝胶制备-积层胶
灌制积层胶
插入梳子
制备凝胶中的要点
• AP要新鲜配制； • 混合搅拌速度太快易产生气泡影响聚合， 导致电泳带畸
形，太慢不均匀； • 分离胶勿倒的过满，需留一定的空间； • 凝胶需缓慢凝固，TEMED、AP用量过多会导致胶太硬，