收稿日期:2008-12-25基金项目:内蒙古自治区优秀学科带头人计划项目(20050802)作者简介:安玉麟(1954-),男,内蒙古土默特右旗人,研究员,硕士生导师,主要从事作物栽培、育种研究工作。
黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及其蛋白产物的Western 2blot 分析安玉麟1,孙瑞芬1,张鹤龄2,郭树春1,闫素丽3(1.内蒙古农牧业科学院生物技术中心,内蒙古呼和浩特 010031;2.内蒙古大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特 010021;3.内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特 010019) 摘要:为进一步研究黑曲酶中国株3.758葡萄糖氧化酶(G OD )在大肠杆菌中的表达水平和条件,将黑曲霉中国株3.758的葡萄糖氧化酶(G OD )基因定向克隆于原核表达载体pET 211a 上,构建了融合表达的重组质粒pET/G O ,转化E.coli BL21(DE3)plysS ,用IPTG 诱导,超声波粉碎细菌细胞,S DS 2PAGE 电泳检测,G OD 基因获得了表达,表达的融合蛋白相对分子质量为66.5kDa 。
用市售葡萄糖氧化酶免疫家兔获得抗血清,酶联法(E LIS A )测定其效价为106,West 2ern 2blot 分析证明表达的融合蛋白与兔抗G OD 血清有较强的特异性,为黑曲霉3.758葡萄糖氧化酶(G OD )抗体的制备奠定了基础。
关键词:黑曲霉3.758;葡萄糖氧化酶基因;融合表达;抗血清;E LIS A ;Western 2blot 中图分类号:T Q920.1 文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2009)04-0084-04Prokaryotic Expression and Western 2blot Analysis of G lucose OxidaseG ene from Aspergillus nigerAN Y u 2lin 1,S UN Rui 2fen 1,ZHANG He 2ling 2,G UO Shu 2chun 1,Y AN Su 2li 3(1.Biotechnology Research Center ,Inner M ong olia Academy of Agriculture and Husbundary Sciences ,Huhhot 010031,China ;2.C ollege of Life Science ,Inner M ong olia University ,Huhhot 010021,China ;3.Agricultural C ollege of Inner M ong olia Agricultural University ,Huhhot 010019,China )Abstract :In order to further study expressed level and condition of G lucose oxidase (G OD )from Aspergillus niger 31758in E.coli ,the coding region of G OD from A.niger 3.758was inserted into the prokary otic expression vector pET 211a ,and the recombinant plasmid was trans formed into E.coli BL21(DE3)plysS.The result of S DS 2PAGE showed that the G OD gene was expressed by IPTG induction ,and the m olecular weight of the fusion protein was about 66.5kDa.An 2tiserum was produced in rabbit immunized with commercial G OD ,and E LIS A analysis proved that the titer of this antibody was 106.The Western 2blotting result confirmed that the antibody reacted specifically to the expressed fusion protein.The study established basis for preparation of G OD antibody from Aspergillus niger 3.758.K ey w ords :Aspergillus niger 3.758;G lucose oxidase gene ;Fusion expression ;Antiserum ;E LIS A ;Western 2blot 葡萄糖氧化酶(β2D 2glucose :oxygen 12oxidoreduc 2tase EC1.1.3.4,简称G OD ),催化β2D 葡萄糖氧化生成δ2葡萄糖酸酯和O 2,O 2被还原生成H 2O 2(β2D 2glu 2cose +O 2→glucose 2δ2lactone +H 2O 2)[1]。
G OD 的活性最早是1928年由Muller 在黑曲霉的抽提物中发现的,后来在黑曲霉[2,3]和青霉[4]中都纯化到了G OD 。
现已从几种微生物中得到了G OD ,但从黑曲霉中得到的G OD 活性最强。
目前G OD 已在临床检测、食品工业、生物传感器、有机酸生产及抗真菌病转基因研究等方面得到广泛应用[5],而且编码G OD 的基因已从不同的真菌菌株中分离、克隆。
Frederick 等[1]和Whittington 等[6]将来自黑曲霉的G OD 基因成功地重组到酵母中,获得了具有生物活性的酿酒酵母G OD 。
Witt 等[7]等在大肠杆菌中表达了青霉G OD 。
国内周亚凤等[8]也在酵母中高效表达了黑曲霉G OD 。
母敬郁等[9]利用高表达分泌纤维素酶的真菌华北农学报・2009,24(4):84287瑞氏木酶表达了重组的黑曲霉G OD。
本试验将押辉远[10]从黑曲酶中国株3.758中克隆的G OD基因连接到原核表达载体中并实现了在大肠杆菌中的表达,为进一步研究黑曲酶中国株31758G OD在大肠杆菌中的表达水平和条件及抗血清的制备奠定了基础。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株与质粒 表达载体pET211a购自德国N ovagen公司,E.coli BL21(DE3)plysS感受态细胞购自清华大学北京天为时代科技有限公司,克隆有G OD基因的重组质粒pMD/G O由内蒙古大学张鹤龄教授惠赠。
1.1.2 酶及主要试剂 限制性内切酶Hin dⅢ(Promega产品)、Bam H I(Fermentas产品);T4DNA Ligase、Mini plasmid DNA kit、DNA MakerⅢ(清华大学北京天为时代科技有限公司产品);E.Z.N.A(R)G el Extraction K it(美国Omega Bio2tek产品);Am p、IPTG X2gal、LA Taq DNA Ploymerase、λDNA/Hin dⅢMaker、低分子量蛋白Maker(T aK aRa公司产品);超速高灵敏度蛋白质电泳快速染液(南京博尔迪生物科技有限公司产品);BAS、T ween20(购自上海生物工程技术服务有限公司);葡萄糖氧化酶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(Sigma公司产品);山羊抗兔IgG2AP、NBT/BCIP染色kit、pNpp(华美公司),其他试剂均为进口或国内分析纯。
1.2 方法1.2.1 引物 引物1,2按文献[11],由北京华大中生科技发展有限公司合成。
1.2.2 G OD基因与表达载体的连接 用Bam H I/ Hin dⅢ双酶切重组质粒pMD/G O和表达载体pET2 11a,得到目的基因小片段和载体大片段,分别回收纯化,回收试剂盒为E.Z.N.A(R)G el Extraction K it,方法按产品使用说明进行。
用T4DNA Ligase将目的片段与载体片段连接。
1.2.3 E.coli感受态细胞的转化 用连接产物转化 E.coli BL21(DE3)plysS感受态细胞,转化方法按产品说明书进行。
筛选培养基中添加Am p、IPTG、X2 gal,同时分别用pET211a空载体和水作对照,在Am p 的平板上筛选阳性重组子。
1.2.4 重组子的鉴定与序列测定 将转化所得白色单菌落,用K ieser法[12]筛选重组质粒,琼脂糖凝胶电泳检测,选取落后于空质粒的单菌落,用快速PCR的方法扩增目的片段。
PCR扩增反应条件为94℃预变性5min,94℃变性30s,63℃退火30s, 72℃延伸3min,30次循环,72℃保温10min;碱裂解法小量提取质粒,用Bam H I/Hin dⅢ双酶切鉴定重组质粒,0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。
随机选取一个重组质粒送到大连宝生物公司测序,鉴定所插入的序列及其读码是否正确。
1.2.5 G OD基因的诱导与表达 挑取测序正确的阳性克隆,接种于10m L含Am p100mg/L的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。
用含Am p100 mg/L的LB液体培养基,以1∶50稀释进行扩大培养,培养至OD600分别为0.6和1.0时,加入诱导剂IPTG使其终浓度分别为0.5mm ol/L和1mm ol/L, 37℃诱导培养2,4,6h,同时以未诱导的重组菌pET/G O培养物及诱导4h的pET211a空载体的诱导培养物作为阴性对照。
1.2.6 细胞内总蛋白质的制备及S DS2PAGE电泳检测表达蛋白 分别取以上未诱导、诱导及只含pET211a空载体的细菌培养物进行细胞内总蛋白质的制备。
制备过程为:将1m L细菌培养物12000 r/min离心2min,弃上清,用灭菌的滤纸条吸干管壁液体。
加100μL冰预冷的50mm ol/L T ris2HCl振荡悬浮菌体,0℃,12000r/min离心1min,弃上清,用灭菌的滤纸条吸干管壁液体。
加50μL ddH2O,菌体分散后,立即加入50μL2×S DS上样缓冲液悬浮沉淀,振荡20s,沸水浴中煮5min,快速冰浴2min以上,超声波粉碎5min,12000r/min离心10min,取上清液5μL进行分离胶7.5%,浓缩胶5%的S DS2 PAGE电泳[13],电泳条件:浓缩胶18mA,分离胶25 mA,同时以黑曲霉葡萄糖氧化酶(G OD)为阳性对照(CK+)。