酸性蛋白酶生产工艺1 蛋白酶、酸性蛋白酶1.1 蛋白酶的定义蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。

同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。

1.2 微生物蛋白酶分类微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。

碱性蛋白酶为透明褐色液体，能与水混溶，最适温度50~60℃，最适pH8.5。

中性蛋白酶为金属酶，褐色颗粒或液体，易溶于水，最适温度45~55℃，最适pH5.5~7.5。

酸性蛋白酶为近乎白色至浅黄色无定型粉末或液体，易溶于水，最适温度45℃，最适pH2.5。

1.3酸性蛋白酶的概述酸性蛋白酶(acidic protease)在 1954 年首先由吉田在黑曲酶中发现。

该酶广泛存在于霉菌、和担子菌中，细菌中极少发现，其最适pH3~4，相对分子质量 30000~40000，等电点（pH3~5）。

酸性蛋白酶主要是一种羧基蛋白酶，大多数在其活动中心含有 2 个天冬氨酸残基。

酶蛋白中酸性氨基酸含量高，而碱性氨基酸含量低。

不同微生物的酸性蛋白酶其氨基酸组成虽有所差别，但性质基本相同，许多性质也与动物胃蛋白酶相似，其活动中心肽键也基本相似，它对 DFP、PCMP （对氯汞苯甲酸）EDTA不敏感，及但能为DNA（二重氮乙酰亮氨酸甲酯）EPNP及（1，2 环-3-对硝基苯养基丙烷），SDS（十二烷基磺酸钠）等抑制。

DNA，EPNP 之所以能引起酶失活是由于活性中心天冬氨酸残基被酯化。

DNA 只同有活性的酸反应，而同失活的酶不能反应。

P-BPB（对溴酚乙酰溴）虽然也可同酶的1个天冬氨酸残基反应，但同它反应的天冬氨酸的位置与以上两种抑制不一样，故不能引起青霉酸性蛋白酶失活。

1.4 酶的生产方法酶的生产方法主要有：提取分离法、生物合成法、化学合成法。

酶的微生物合成法主要有：液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞培养、固定化原生质发酵。

酸性蛋白酶用微生物发酵法生产，采用液体深层发酵。

液体深层发酵是指液体培养基在发酵罐中灭菌冷却后，接入产酶细胞，一定条件下发酵，适用于微生物细胞、动植物细胞的培养。

具有机械化程度高、技术管理严格、酶产率高、质量稳定，产品回收率高的特点，是目前酶发酵的主要方式。

1.5酸性蛋白酶制剂的性能1.5.1 酸性蛋白酶的作用机理酶是一种蛋白质，它是活细胞产生的生物催化剂，生物体的新陈代谢活动都离不开酶的作用。

酶的种类很多，酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸环境下（pH2．5～4．0）水解动植物蛋白质，通过内切和外切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸。

1.5.2 pH对酶活及酶稳定性的影响酸性蛋白酶稳定pH范围2.0～4.0之间，最适pH2.5，pH低于2．0、高于4．0将影响水解速度。

1.5.3 温度对酶活性及稳定性影响酸性蛋白酶适宜温度范围30℃～50℃，最适作用温度为50℃，低于40℃酶活稳定，超过50℃，酶活性损失严重。

1.5.4 金属离子对酶活力的影响酸性蛋白酶可被Mn2＋、Ca2＋、Mg2＋离子激活，被Cu2＋、Hg2＋、Al3＋离子抑制，液体酸性蛋白酶，长时间存放碳钢罐中失活较多。

1.5.5 酸性蛋白酶制剂酶活力定义酸性蛋白酶活力是指1克固体酶粉或1ml液体酶，在45℃左右和pH2.5条件下，1分钟水解酪酸蛋白产生1微克酪氨酸即为一个酶活力单位。

酸性蛋白酶45℃酶活力为50138U左右。

2 酸性蛋白酶的生产2.1生产菌株的选择目前已经用于生产酸性蛋白酶的微生物菌株有：黑曲霉、米曲霉、拟青霉、啤酒酵母、乳酸杆菌、枯草杆菌等，其中以黑曲霉为主，这些曲霉产生的蛋白酶有一定的耐酸性和耐热性。

我国生产酸性蛋白酶的菌株有黑曲霉AS 3.301，AS 3.350等。

黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌，菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成，菌丛黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。

黑曲霉具有多种活性较强的酶系，如 CX 酶、淀粉酶、酸性蛋白酶等，可将原料中的纤维素等大分子化合物降解转化为动物易消化利用的养分，并为白地霉、酵母菌提供必需的糖、氨基酸等。

黑曲霉可以用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶，主要用于酸性蛋白酶等的生产。

2.2酸性蛋白酶发酵工艺图2.3发酵培养基产酸性蛋白酶的微生物，它们的发酵培养基都基本选择麸皮、米糠、玉米粉、淀粉、饲料鱼粉、豆饼粉、玉米浆等各种碳氮源，按各种不同比例混合，添加无机盐配成各种培养基。

C源：蛋白酶的生产既受分解代谢产物阻遏也受底物的诱导。

葡萄糖等容易利用的碳源常可引起分解代谢阻遏使产酶降低，因此通常用大麦粉、玉米粉、淀粉，有时也用麦芽糖做碳源。

黑曲霉生产酸性蛋白酶时利用玉米粉作为碳源。

N源：黑曲霉生产酸性蛋白酶时需要较高浓度的氮源浓度，在有机氮存在时，NH4+或NO3-对黑曲霉生产酸性蛋白酶有显著促进作用。

故一般采取高浓度的有机氮并辅与浓度为1%--3%的无机氮。

有机氮常用蛋白胨、豆饼粉、鱼粉的石灰水解物等。

无机盐：磷酸盐对微生物蛋白酶的生产很重要。

磷酸盐对微生物蛋白酶的生产很重要，使用麸皮、米糠等含磷较丰富的原料时，添加磷酸盐对产酶具有促进作用，在黑曲霉3.350酸性蛋白酶的生产培养基中添加0.1%~0.3%的磷酸盐可使酶活性提高20%~30%。

Ca2+对某些菌株产蛋白酶具有很大影响，培养基中添加0.5%CaCl2黑曲霉3.350酸性蛋白酶的产量会提高40%左右。

其他成分：向培养基中添加适量表面活性剂可以改善细胞膜的通透性或诱导酶的生成，在一定条件下可显著促进蛋白酶的生产。

下面列出的是黑曲霉3．350发酵培养基的配方：玉米粉 6％豆饼粉4％玉米浆 0.6％氯化铵 1.0％氯化钙 0.5％磷酸二氢钠0.2％豆饼石灰水解液10％2.4 发酵条件控制（1）接种量：适当控制接种量对菌株产酸性蛋白酶的活力关系很大。

一般接种量为5%~10%，且有研究表明5％的接种量比10％的接种量要好。

（2）pH：pH对于生产酸性蛋白酶的菌株来说，培养基的起始pH对其产量有较大的影响，黑曲霉酸性蛋白酶的最适pH是2.5~2.7，但黑曲霉AS 3.350发酵产生酸性蛋白酶培养基的最初浓度应调节为4.5~5.5左右。

（3）温度：黑曲霉酸性蛋白酶生产对于温度的变化很敏感，黑曲霉正常发酵控制在30℃左右。

（4）通风量：液体深层培养中大部分微生物在合成蛋白酶时需要强烈搅拌通风。

氧是黑曲霉生物合成酸性蛋白酶必须的，通风量较大对产酸性蛋白酶有利，通风气量不足对黑曲霉菌丝体的生长无明显影响，但对酶产量有严重的影响，实验表明：在 500L 发酵罐中，使用黑曲霉3.350发酵生产酸性蛋白酶的时候，前24h 前的通风量为0.25VVm，24～48h 0.5VVm，48～72h 1.0VVm。

在48h通风量如果未及时增至 1.0VVm，就会导致产酶降低，即使恢复了正常的通风量，但为时已晚，酶的活性减少 1/3。

如果后期通风量减少到0.25VVm，就会导致产酶偏离正常范围。

可在黑曲霉生产酸性蛋白酶的时候，前期的通风量对酶的影响更为明显，短暂停止通风搅拌会导致酶产量急剧下降。

因此发酵工程中应控制好通风量，0~24h为1:0.25,24~48h为1:0.5,48h至结束为1:1.0，发酵周期为72h左右。

（5）氧载体：在发酵过程中，在发酵培养基中加入正十二烷、全氟化碳，液态烷烃(为12—16碳直链烷烃混合物)等氧载体，使培养基中氧传递速度加快，产生气泡少，剪切力小，能明显提高菌株产酸性蛋白酶的量。

（6）灭菌：工业发酵稳产的关键条件之一是在整个生产过程中维持纯种培养，避免杂菌的入侵。

行业上把过程污染杂菌的现象简称染菌。

染菌对工业发酵的危害，轻则影响产品的值和量，重则倒灌，颗粒无收，严重影响工厂的效益。

应该注意对培养基、发酵罐、通入空气等进行灭菌，包含空消和实消等过程。

（7）消泡：泡沫堆积多降低了发酵罐的装料系数；增加了菌群的非均一性；增加了污染杂菌的机会；大量起泡会引起逃液，招致产物流失；消泡剂的加入有时会给发酵或提炼加工带来不便。

因此，应该尽量避免泡沫的产生。

2.5 菌种的扩培在扩培之前应该选出催化高效的菌株，一般采取的是紫外线放射的方法获得着类菌株但是效果不是很明显，把筛选出的具有高效发酵能力的菌株进行扩大培养，以得到发酵所需要的大量菌种，扩培工艺流程：原菌种→斜面试管培养→液体试管培养→三角瓶培养→卡氏罐培养2.6酸性蛋白酶提取工艺酸性蛋白酶生产的最后一道工艺就是提取，提取的方法主要有盐析沉淀法、单宁酸沉淀法，或者采取多种方法结合来提取酸性蛋白酶。

2.6.1 盐析沉淀法将培养物滤去菌体用盐酸调节pH4.0以下，加入硫酸铵至浓度55%，静置过滤弃上清液，将沉淀压滤去母液，于40℃烘干磨粉，得到工业用的粗制酶制剂粉末。

亦可将发酵液滤除菌体后，使用刮板式薄膜蒸发器40℃浓缩3~4倍，可直接作为液体的粗酶制剂商品。

医药和啤酒工业用酶需盐析后进一步用离子交换树脂脱色处理，然后浓缩并以阳离子树脂脱盐，最后干燥、磨粉，得到淡黄色或乳白色粉末。

2.6.2 单宁酸沉淀法单宁酸是一种离子型表面活性剂，能与蛋白质形成复合物而使其沉淀，将发酵液过滤后调节pH5.5左右，在搅拌下向滤液中加入10%单宁酸，使单宁酸的终浓度为1%左右，静置1h，离心收集酶与单宁酸的复合物。

接着向此复合物中加入10%聚乙二醇（相对分子质量6000）溶液，使聚乙二醇用量为原酶液的0.3%~0.5%。

然后不断搅拌，离心去除单宁酸聚乙二醇聚合物（浓缩量10倍，收率90%以上），再将浓缩酶液调节pH4.5左右，加入糖用活性炭3%脱色，得到浅黄脱色酶液（回收率90%~95%）。

脱色液在低温下以乙醇沉淀活用硫酸铵盐析，干燥后制得浅色酶粉，其活性可达40～60万U以上，总收率70%以上。

2.7酸性蛋白酶的结晶酸性蛋白酶的结晶方法有沉淀和离子交换柱层析两种方法。

这里只介绍离子交换柱层析。

离子交换柱层析使用弱酸性阳离子交换树脂如：粗孔型 Amber-lite IRCXE-64,CG-10,Duolite CS101 等吸附。

操作方法是：将 Duolite CS101（110～170 目）装入3×70cm 柱中，将溶于 0.1mol/L 醋酸钠-盐酸（pH3.5）缓冲液的酶液通过柱子，控制流量每小时 30ml，收集流出液每分钟 10ml，测定酶活性和蛋白含量（Folin 法或紫外分光法），然后用水或 0.02mol/L 醋酸钠-盐酸（pH 3.55）缓冲液洗柱，淀粉酶首先洗脱，然后改用 0.5mol/L 醋酸钠-盐酸（pH 5.2）缓冲液洗柱，蛋白酶的收率 60%～70%，经过盐析，丙酮结晶，收率高于沉淀法结晶。

2.8 提高酸性蛋白酶产量的措施（1）添加诱导物包括酶的作用底物、反应产物、作用底物的类似物等。