工业微生物 chap10 微生物与现代发酵工业第十章微生物与现代发酵工业发酵现象，具有与地球上生命体的诞生同样长的历史，有史以来就被人类所认识。

几千年来，微生物一直被用来生产面包、啤酒和葡萄酒等产品。

第二阶段的传统发酵技术开始于第一次世界大战期间，发展了丙酮-丁醇和甘油发酵技术。

随着生物化学的进展以及对发酵机理和代谢调控理论研究的深入，发酵产品扩展到柠檬酸、苹果酸等有机酸、氨基酸、核苷酸等食品添加剂、酶制剂、维生素和抗生素等药品。

在20世纪70年代初期，传统的工业微生物学与分子生物学结合起来，制造出40多种生物制药产品，例如红细胞生成素、人体生长激素、干扰素等。

今天，微生物学在全球工业中扮演重要的角色，尤其在制药、食品和化学工业中，微生物是主要的参与者。

第一节微生物发酵生产酒精一、发酵法酒精生产的传统技术酒精发酵是最重要的发酵工业之一。

酒精是由多糖降解成可发酵性的糖后，酿酒酵母或假单胞菌属细菌再将六碳糖，或是脆壁克鲁维酵母、假丝酵母等将乳糖或戊糖酵解而得到的。

如果是由淀粉质原料制造酒精，先将原料蒸煮后，冷至60℃左右，加麸曲或液曲进行糖化制成糖化醪，送入发酵槽加酒母醪进行发酵，再行蒸馏出酒精。

而由糖蜜发酵生产酒精时，用制备酵母醪的稀糖蜜在纯粹培养器中进行灭菌、冷却，再接种酵母菌进行发酵，最后经蒸馏产出酒精。

1. 与酒精发酵有关的微生物由淀粉质原料发酵生产酒精，第一步将淀粉通过糖化剂的作用，转变为可发酵糖。

糖化剂所用霉菌有曲霉与根霉两大类。

第二步将发酵糖通过酵母菌或细菌的作用转变为酒精。

曲霉属中用于酿酒的种属主要有：米曲霉、泡盛曲霉、甘薯曲霉、宇佐美曲霉、黑曲霉NRRL330、NRRL337、臭曲霉、海枣曲霉和黑曲霉AS3.4309。

常用的根霉有鲁氏毛霉、日本根霉、东京根霉及爪哇根霉。

国外酒精工厂常用的酵母菌，以德国Lindner氏发现的RasseⅡ及RasseⅫ最为著名。

我国使用淀粉质原料制造酒精的工厂所用的酵母菌多为酿酒酵母K。

以糖蜜为原料的酒精厂多数使用台湾酵母来酿造。

2. 应用曲法由淀粉质原料发酵生产酒精薯干、玉米、高粱等淀粉质原料均可用糖化剂使淀粉转变为单糖后，再由酵母菌将糖转变为酒精。

由淀粉质原料发酵生产酒精，以糖化剂的选择最为重要。

酒精发酵所用糖化剂最初是麦芽，但因麦芽价昂，故已不再使用。

我国所用的糖化剂最初为固体曲，所用菌种最初为米曲霉培养的黄曲，因其所含糖化酶不耐酸，所以发酵效率较低（约75％～80％），以后改用黑曲霉培养的黑曲，发酵效率提高至90％～92％。

固体曲操作不便，不适合大规模生产，以后改用液体曲，为酒精工业一大革新。

3. 由糖蜜发酵生产酒精糖蜜有甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两种，由于原料不同，酒精发酵方法亦略有差异。

但生产工艺类似，都是先将糖蜜稀释后，加入硫酸铵、氯化钠、硫酸或盐酸等营养盐，再加热灭菌，供制备发酵醪之用。

使用糖蜜发酵生产酒精时，必须采用纯菌培养的酵母菌，一般应用连续发酵法来生产酒精，但目前连续发酵法渐被酵母细胞再循环法（固定化酵母细胞法）所代替。

二、发酵法酒精生产的新技术当今的酒精生产技术是以微生物学、生化技术、材料学、机械学、电子学等学科为基础，生产方法在原有基础上发生了很大变化，尤其是发酵法生产酒精的新工艺、新技术取得了迅猛发展。

遗传技术、分析技术、电子自动化控制技术、后处理技术、膜分离技术等新技术的广泛应用，使传统的手工生产实现了自动化、机械化，生产水平上了一个新台阶。

目前，世界各国酒精生产大都采用固定化酵母或活性干酵母进行连续发酵工艺。

以下将近些年来，在酒精生产过程出现的一些新工艺和新技术装备详细介绍。

1. 应用酶解纤维素原料生产酒精生产酒精的原料以淀粉、糖蜜为主。

由于世界粮食问题日益严峻，目前以纤维素、半纤维素、水果作为原料生产酒精越来越多。

（1）由纤维素发酵生产酒精过去均是采用酸水解法，将纤维素降解为葡萄糖，现在多半是采用纤维素酶来水解纤维素。

许多微生物都能产生纤维素酶，其中里斯木霉（绿色木霉）在工业上已经普遍应用。

一般是从自然界真菌中进行筛选，得到纤维素酶活力最强的野生型菌株，再经紫外线或亚硝基胍人工诱变，使得纤维素酶活力逐渐提高，再按一般发酵方法进行发酵。

日本采用固定化纤维素酶法，将纤维素酶与疏水单体在超低温（液氮）下，用γ射线进行聚合制成固定化纤维素酶，不但酶的活力不受损失，且可用辐照预处理的固形纤维素进行表面的酶反应。

此外，还供给一些由固定纤维素产生菌（如绿色木霉）产生的纤维素酶，将纤维素糖化为糖液后，进行酒精发酵。

还可以直接由纤维素生成乙醇，能够直接利用纤维素的微生物以热纤梭菌（Clostridium thermocellum）为最有名。

此菌是从棕榈酒分解而得的，它具有纤维素分解力，此菌的纤维素酶活力不如木霉，但对纤维己糖转变为纤维三糖的速度与木霉相等。

据报道热纤梭菌ATCC27405的纤维素酶在Ca2+和硫代还原剂，尤其是在二硫代苏醇存在下，对天然棉花或纤维素衍生物（微晶纤维素和滤纸）的溶解力与里斯木霉纤维素酶相同。

另外还发现粗糙脉胞菌也可以分泌纤维素酶，并有由纤维素发酵为乙醇的能力。

在最适条件下，粗糙脉胞菌可在4日内由1%微晶纤维素和2%用碱处理的纤维素分别生成5.5和10 g/L 的乙醇。

其转化率分别为100%和90%。

热纤梭菌既具有纤维素分解力，又具有由葡萄糖生成乙醇的能力，但单独使用热纤梭菌进行发酵时，发酵既慢，乙醇浓度亦低。

因此目前还没有工业化，但如果采用混合发酵法，即纤维素先用热纤梭菌CF-11在50℃，保温3天后，再接种发酵单胞菌（Zymomonas）Z2，在37℃保温6天，使热纤梭菌由纤维素转变的葡萄糖再转变为乙醇，在1%纤维素中混合培养的乙醇数值比单用热纤梭菌的高9倍。

热纤梭菌可水解纤维素为己糖和戊糖，但不能利用戊糖，为此，把能够利用戊糖的嗜热糖梭菌与热纤维梭菌混合培养。

在流加木糖的发酵条件下，培养6天，乙醇浓度可达12g/L。

（2）由半纤维素发酵生产酒精纤维素原料除含纤维素外，还含有大量的半纤维素，因此利用半纤维素生成酒精的发酵方法，也引起人们的注意。

半纤维素可用稀酸水解为戊糖，许多细菌可以转变戊糖为乙醇，但副产许多代谢产物，如混合酸和2，3-丁二醇等，而且乙醇生产力很低，不切实用。

大多数酵母菌缺乏木糖异构酶，因此不能转变戊糖为乙醇。

近年发现一些酵母菌，如管囊酵母等则有转变戊糖为乙醇的能力。

由于酵母缺乏木糖异构酶，所以先将木糖用木糖异构酶异构化为木酮糖后，才可用一般酿酒酵母进行乙醇发酵。

也可应用细菌直接对木糖进行发酵，其产物和产量依细菌种类和发酵条件而定。

嗜水气单胞菌、多黏芽孢杆菌和产吲哚气杆菌可为细菌的代表，由己糖和戊糖生成混合酸、2，3-丁二酸和乙醇。

梭菌属中有二个菌种可由纤维素和半纤维素生成乙醇、乳酸和醋酸。

例如热氢硫酸梭菌可以发酵纤维素、己糖和戊糖而生成乙醇。

据报道，浸麻芽孢杆菌由1%木糖发酵生成乙醇时，木糖的98%均被消耗。

其乙醇生产力为0.8g/（g·h），为酿酒酵母的1/4。

2. 酒精发酵微生物的改良酒精发酵微生物以α-淀粉酶产生菌、糖化酶产生菌和酵母菌为主，随着分子生物学技术的广泛应用，酒精发酵微生物的育种大有进展。

（1）耐高温α-淀粉酶的应用目前用于生产乙醇的大部分原料为淀粉质原料，由于在高浓度酒精生产过程中使用了较高浓度的原料，采用连续蒸煮器需要能耐高温的α-淀粉酶，经蒸煮后，黏度非常大，这样在淀粉糊化过程中必须加入α-淀粉酶液化淀粉，降低黏度，便于随后的酒精发酵。

工业上所用的α-淀粉酶生产菌株有枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌等微生物，前者产生的淀粉酶最适作用温度为60～70℃，耐热能力多在80～85℃之间。

而后者产生的α-淀粉酶为耐高温α-淀粉酶，最适作用温度为95℃，最高作用温度为105℃，并且高浓度底物和钙离子对其具有稳定作用。

目前，丹麦生产的Termamyl（由地衣芽孢杆菌产生的）能耐110℃的高温。

国内外均在采用重组DNA技术构建耐热性α-淀粉酶，例如复旦大学用pBR 322作为克隆载体，从嗜热脂肪芽孢杆菌658染色体上克隆了两个α-淀粉酶同功酶基因，带有这两个基因的两个克隆株所产生的α-淀粉酶活力都比亲株的活力高，现在已将耐热型α-淀粉酶基因亚克隆到枯草芽孢杆菌质粒pUB110上，该基因已在枯草杆菌中稳定地表达，且酶活性比在大肠杆菌中表达的有进一步的提高。

使用这种耐热型淀粉酶可以用于生产高浓度酒精，所用的淀粉质量浓度为0.35g/ml，首先让淀粉浆通过胶体磨。

在这过程中，淀粉分子从刚刚膨胀的淀粉颗粒上脱落下来，然后淀粉悬液与α-淀粉酶混合均匀。

在90℃下让此混合液在匀浆器中重复循环，温度升到90～105℃，液化一定的时间，淀粉醪液冷却到40℃，加糖化酶糖化，并利用耐酒精酵母进行发酵，发酵结束后，95%的淀粉被转化成酒精，最后的发酵醪中含有体积分数为21%的乙醇。

（2）糖化酶产生菌的选育糖化酶产生菌有根霉和曲霉两大类。

根霉通过人工诱变可以提高糖化力，例如，将台湾根霉R13-5用紫外线和MNNG处理后，所得的变异株R13-59136生产的糖化酶与亲株R13-5相比，用麸曲式固体培养时糖化酶提高5.7倍，用液体深层培养时提高15倍。

过去通用的曲霉以黑曲霉NRRL330和其他黑曲霉为主，以后又从土壤中分离出一种黑曲霉，经诱变后，获得的臭曲霉ATCC14916，它的糖化力比黑曲霉NRRL330高1.1倍。

将ATCC14916再行紫外线照射，获得的变异株，糖化力又提高了1.6倍。

（3）酒精酵母的选育在传统酒精发酵工艺中，所用的糖质量浓度一般在0.16～0.25 g/ml范围内，所用的酵母菌只能产生体积分数为6％～12％的乙醇，更高的底物浓度和乙醇浓度对酵母菌生长和发酵会产生抑制作用。

所以，近年来有些国家的研究者致力于筛选和构建既能发酵又能糖化，同时能抗更高底物浓度和酒精浓度，抗高温的酵母菌，并把这些酵母菌应用于超浓醪（Very High Gravity，简称VHG）发酵生产高浓度酒精。

这种酒精生产工艺可以节省发酵和蒸馏过程中的能量消耗，提高设备利用率，减少劳动力和提高酒精产量。

3. 应用细菌的酒精发酵法假单胞菌属的一些细菌与酵母菌酒精发酵的途径不同，即按ED途径进行酒精发酵。

近年来，运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）已成为酿酒酵母之外发酵生产酒精的第二大菌种，因为与传统的酵母菌发酵生产酒精相比，该菌具有下列优点：①耐高糖能力（400g/L）；②耐乙醇能力高（100 g/L）；③低生物产量和高乙醇收率（在厌氧条件下，每消耗1mol/L葡萄糖，可得 1.9mol/L乙醇）；④比生产速率和发酵速度快。

但从菌种特性上运动发酵单胞菌也存在不少缺点：该菌一大弱点是底物范围狭窄，据目前所知，只有以葡萄糖和果糖为碳源有良好效果，蔗糖发酵则有一定困难，会产生大量副产物果聚糖和山梨醇，其他糖类和脂肪酸均不能利用作为碳源，在生产上细菌发酵容易染菌，对pH值的控制上也比酵母严格得多，此外，该菌培养时会分泌一种胞外物，导致培养基黏度增加和形成稳定的泡沫等。