需要的基本物质： 需要的基本物质： DNA模板 模板 启动子、 启动子、结构基因 转录终止子 RNA聚合酶 聚合酶 四种核糖核酸 转录因子
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
1、基因体内转录的过程 、
原核基因转录
真核基因转录
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
2、基因体外转录的原理 、 基本的工作原理是以DNA为模板，在转录体系中 的一系列转录因子的作用下，经RNA聚合酶合成 RNA RNA。 基因体外转录体系在1976年由 年由PELHAM和 基因体外转录体系在 年由 和 JACKSON建立。体外转录体系逐渐成熟。 建立。 建立 体外转录体系逐渐成熟。
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
3、基因体外转录的操作 、 聚合酶（ （1）RNA聚合酶（RNA Polymerases ） ） 聚合酶
常用的聚合酶为噬菌体来源的RNA聚合酶 聚合酶 常用的聚合酶为噬菌体来源的 T7 、SP6、T3 、 特异识别模板启动子 转录效率比大肠杆菌的聚合酶效率高 酶的来源及质量高
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
3、基因体外翻译系统 、 （2）麦芽提取物 Wheat Germ Extract ） 麦芽提取物是不同于网织红细胞裂解物的另一个无细胞 体外合成体系。由于内源的mRNA很少，这个系统可用于各种 病毒、酵母、高等植物乃至哺乳动物蛋白的合成。当表达产物 较难与球蛋白区分（12—15kD）、或者表达产物正好可能是 哺乳动物细胞中富含而植物中没有的调控因子一类的蛋白时、 或者是不明原因表达不出时，就不妨尝试麦芽提取物体系。不 过要记住，这个体系要求RNA有帽子结构才能更好的翻译。 如果上述情况又无法给RNA加帽，就只好借助大肠杆菌体系 了。
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
3、基因体外翻译系统 、 （1）兔网织红细胞系统 ）
兔网织红细胞用新西兰大白兔制备 ，通过纯化除去兔网织红细胞以外的污 染细胞。 染细胞。 网织红细胞裂解后，提取物用微球菌核酸酶破坏内源mRNA，最大限度降 网织红细胞裂解后，提取物用微球菌核酸酶破坏内源 ， 低翻译背景。 低翻译背景。 裂解物包含蛋白质台成所必须的细胞内组分(tRNA，核糖体，氨基酸，起 裂解物包含蛋白质台成所必须的细胞内组分 ，核糖体，氨基酸， 延伸、终止因子)。 始、延伸、终止因子 。 为使系统更适于mRNA 的翻译，兔网织红细胞中还添加了磷酸肌酸和磷酸 的翻译， 为使系统更适于 肌酸激酶的能量生成系统，以及氯化高铁血红素防止翻译起始的抑制， 肌酸激酶的能量生成系统，以及氯化高铁血红素防止翻译起始的抑制，此外 还添加了tRNAs混合物用于扩大 混合物用于扩大mRNA翻译的范围，以及乙酸钾和乙酸镁等。 翻译的范围， 还添加了 混合物用于扩大 翻译的范围 以及乙酸钾和乙酸镁等。 兔网织红细胞具有一定的翻译后加工活性，包括翻译产物的乙酰化， 兔网织红细胞具有一定的翻译后加工活性，包括翻译产物的乙酰化，异戊 二烯化，蛋白酶水解和一些磷酸化活性。 二烯化，蛋白酶水解和一些磷酸化活性。信号肽切除以及蛋白质糖基化等翻 译后加工事件可以通过加入犬微粒体膜来实现。 译后加工事件可以通过加入犬微粒体膜来实现。
质粒（ 质粒（Plasmids ）
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二、基因体外转录原理与操作
3、基因体外转录的操作 、 模板（ （2）线形的 ）线形的DNA模板（linear DNA template ） 模板
PCR产物（PCR Products） 产物（ 产物 ）
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
3、基因体外翻译系统 、 （1）兔网织红细胞系统Rabbit Reticulocyte Lysate ） 网织红细胞由红细胞分化而来，在体内主要是负责合成大量 血红蛋白（90%以上），以及球蛋白。这种未成熟的红细胞本身 不带细胞核，但却保留了这种高效翻译各种核酸信息的能力，可 减少背景，即使在较低的丰度下也能比较高效地合成产物。 根据测定，体外合成外源蛋白的效率接近完整网织红细胞自 身合成内源蛋白的效率。此外网织红细胞体系内源的核酸酶很少， 有助于长链RNA的稳定（包括有帽子或者没帽子结构的RNA）， 因而可以合成较大的蛋白。网织红细胞体系是最有希望做到微粒 体糖基化的体系。
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
3、基因体外翻译系统 、 （1）兔网织红细胞系统 ） 体外翻译系统中 兔网织红细胞系统是 真核体外翻译系统中 应用最广泛的一种， 常用于较大的mRNA 种类鉴定，基因产物 性质的分析，转录和 翻译调控的研究，以 及共翻译加工的研究 等。
基因体外转录与翻译
3、基因体外转录的操作 、 模板（ （2）线形的 ）线形的DNA模板（linear DNA template ） 模板
寡核苷酸（ 寡核苷酸（Oligonucleotides ）
CDNA
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
3、基因体外转录的操作 、 （3）基本反应体系 ）
基因体外转录与翻译
Genetic Engineering
主讲人: 主讲人 杜珍武
E-mail:phdzhw@
吉林大学 药学院
2010-12-14
基因工程教研室
1
基因体外转录与翻译
基因体外转录与翻译
in vitro transcription/translation 一、基因体外转录与翻译的意义 二、基因体外转录原理与操作 三、基因体外转录应用 四、基因体外翻译的原理与操作 五、基因体外翻译的应用
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
3、基因体外翻译系统 、 （3）细菌提取物 ）
E. coli Cell-Free System
原核系统主要利用大肠杆菌的提取物进行表达。 原核系统主要利用大肠杆菌的提取物进行表达。利用大肠杆菌体系进 行体外表达，某些蛋白质每小时每个反应（ 行体外表达，某些蛋白质每小时每个反应（50ul）产物量可高达数百微克， ）产物量可高达数百微克， 在优化的批量系统中蛋白最终的产量达到1mg/ml也是可能达到的，这一 也是可能达到的， 在优化的批量系统中蛋白最终的产量达到 也是可能达到的 产率还可以通过连续反应器进一步得到提高。 产率还可以通过连续反应器进一步得到提高。 人们可以根据需要加入特殊添加剂如蛋白酶抑制剂，分子伴侣， 人们可以根据需要加入特殊添加剂如蛋白酶抑制剂，分子伴侣，代谢 非天然氨基酸甚至是少量的变性剂， 物，非天然氨基酸甚至是少量的变性剂，也可掺入特殊标记的氨基酸获得 带标记蛋白质。这样这种体系的弹性就非常大， 带标记蛋白质。这样这种体系的弹性就非常大，可以加入许多其它优化成 份以提高产率和提高溶解性。 份以提高产率和提高溶解性。 大肠杆菌的材料来源成本最低，实用性高， 大肠杆菌的材料来源成本最低，实用性高，表达效率也高
基因体外转录与翻译
三、基因体外转录应用
1、制备病毒RNA片段 、制备病毒 片段 用于证明病毒的侵染性 利用长链RT-PCR技术方法 利用长链RT-PCR技术方法 扩增出病毒全长cDNA，克隆入 扩增出病毒全长 ， 带有T7 聚合酶启动子质粒， 带有 RNA聚合酶启动子质粒， 聚合酶启动子质粒 以此cDNA为模板作体外转录， 为模板作体外转录， 以此 为模板作体外转录 转录产物转染细胞后观察到了典 型的病毒病变。 型的病毒病变。从而判定病毒的 侵染性
锤头状核酶
基因体外转录与翻译
三、基因体外转录应用
4、获得RNA探针 、获得 探针
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
1、基因体内翻译的过程 、
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
2、基因体外翻译的原理 、 无细胞蛋白质合成系统是一种以 外源mRNA或DNA为模板 通过在细 为模板,通过在细 外源 或 为模板 胞抽提物的酶系中补充底物和能源 物质来合成蛋白质的体外系统. 物质来合成蛋白质的体外系统 与传统的体内重组表达系统相 比,体外无细胞合成系统具有多种优 体外无细胞合成系统具有多种优 点,如可表达对细胞有毒害作用或含 如可表达对细胞有毒害作用或含 有非天然氨基酸(如 氨基酸 氨基酸)的特 有非天然氨基酸 如D-氨基酸 的特 殊蛋白质,能够直接以 能够直接以PCR产物作为 殊蛋白质 能够直接以 产物作为 模板同时平行合成多种蛋白质,开展 模板同时平行合成多种蛋白质 开展 高通量药物筛选和蛋白质组学的研 究等. 究等
基因体外转录与翻译
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
一、基因体外转录与翻译的意义
基因体外转录与翻译
一、基因体外转录与翻译的意义
体内操作
费事、费力、 费事、费力、工序烦琐
？？？
体外操作
研究蛋白质、 研究蛋白质、RNA方便需要 方便需要
快速、方便获得蛋白质、RNA
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
1、基因体内转录的过程 、
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
3、基因体外转录的操作 、 聚合酶（ （1）RNA聚合酶（RNA Polymerases ） ） 聚合酶
基因体外转录与翻译
二、基因体外转录原理与操作
3、基因体外转录的操作 、 模板（ （2）线形的 ）线形的DNA模板（linear DNA template ） 模板 要求： 聚合酶识别的双链启动子， 要求：有RNA聚合酶识别的双链启动子，被转录基 聚合酶识别的双链启动子 因。
基因体外转录与翻译
四、基因体外翻译的原理与操作
3、基因体外翻译系统 、 （3）细菌提取物 ）
E. coli Cell-Free System
s30原核体外翻译系统的E．colis30提取物是由OmpT内 切蛋白酶和Lon蛋白酶缺陷的E．coliB菌株制备，所以在s30 系统中表达基因可以增加产物的稳定性，尤其适用于在体外表 达时易被蛋白酶降解的蛋白质 。s30体外翻译系统也适台表达 那些在体内表达时由于宿主编码的抑制酶作用而表达水平低的 蛋白质，使其能高水平表达 。s30系统还可用于转录和翻译调 控的研究 此外，s30体外翻译系统的应用还包括台成少量标记 蛋白质用于蛋白纯化中作为示踪物质以及在蛋白质中掺人非天 然的氨基酸用于研究蛋白质的结构功能