哺乳动物体细胞克隆技术研究现状及其存在的问题 马志杰１ （生命科学与技术学院遗传育种与繁殖专业 四川成都 ６１００４１） 摘要具有划时代里程碑的作用关键技术及研究现状然后 关键字： 哺乳动物 体细胞 重组胚胎 克隆 1997年2月英国Rosolin研究所的科学家W ilmut等人宣布了克隆羊的诞生[1] 相对于之前的动物克隆技术而言自诞生以后经过５年多的时间并获得了重要的理论成果与实际应用体细胞克隆技术还存在理论与技术上的缺陷与不足克隆其含义是无性繁殖在这个细胞系中哺乳动物克隆又称核移植技术显微操作对哺乳动物特定发育阶段的核供体及相应的核受体进行体外重构胚胎移植通过核移植产生的动物其遗传结构与细胞核供体完全相同所用的供体细胞若为体细胞 2 哺乳动物体细胞克隆技术的主要环节及其研究现状 哺乳动物体细胞克隆技术主要包括以下5个主要环节激活技术； (4) 重组胚的体内或体外培养； (5) 重组胚胎的移植 2.1供体核的准备 最早人们用青蛙肠粘膜上皮细胞的核作为供体核获得后代多莉实验表明并非一切体细胞都可作为供核细胞进行核移植故目前大多数家畜的克隆都以它为供核细胞[3]ÊäÂѹܼ°×Ó¹¬ÉÏƤϸ°û¿ÅÁ£Ï¸°ûÒ»°ãÑо¿ÈÏΪCampbell(1996)[4]认为并首次采用血清饥饿法使供核细胞同期化在Go期也有科学家对此提出质疑饥饿过程并不是一个必要的过程在处于活跃分裂期的仔猪胎儿成纤维细胞培养物中Kubota等(2000)[7]的实验表明马志杰 收稿日期０６血清饥饿培养对核移植胚胎融合率但对重组胚胎的妊娠成功率有较大的影响饥饿法处理有助于重组胚胎后期的发育在当前体细胞克隆成活率低的情况下血清饥饿法以期获得较高的成功率 2.2受体细胞质的选取 研究人员早期曾以受精卵或去核2-细胞胚作为受体卵成熟卵母细胞比受精卵或2-细胞胚更适合于用作核移植的受体细胞质重新编序近年来通常以第二次减数分裂中期卵母细胞取代原核受体1999年猪或大鼠的皮肤成纤维细胞作为供核体细胞卵母细胞采集后在培养液中培养成熟至第一极体排出一般去核的方法有盲吸法以往很多人采用盲吸法效果不佳去核效果可达90%以上事先在HSOF一类的培养液中５靏／ｍｌＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２和7.5ìg/ml细胞松弛素B制成染色剂在DNA被染色后因此丹麦的Vajta等(2001)[11]发明了一种新的核移植方法培养的卵母细胞至成熟于0.5%的链蛋白酶中培养5分钟去除卵细胞的透明带紫外光下挑选不含染色体的胞质体体细胞形成双胞质体－体细胞三联体的重组胚胎简化了预备工作预计在体细胞核移植中将会被广泛采用去掉卵母细胞的细胞核是核移植胚胎发育的先决条件之一否则或者两个细胞核相互干扰 2.3核质重组融合方法是用注射针吸取供核细胞如Onishi等(2000)用此法获得克隆猪成功率偏低早前采用仙台病毒法激活核质已较少采用将重组胚胎置于融合小室内在一定的电场强度下近年来如离子素钙离子载体A23187和钙离子酶素等或单独或混合使用进行化学激活效果均令人满意[8, 12]ÓÐÌåÄÚºÍÌåÍâÁ½ÖÖÅàÑø·½Ê½¾-ÊýÌìºó¼ì²â·¢ÓýÕý³£µÄÄÒÅß»òÉ£¿°ÅßÌåÍâÅàÑøÊǽ«¼¤»îºóµÄÖØ×éÅßÔÚÅàÑøÒºÖÐÅàÑøÖÁÄÒÅßOnishi(2000)在猪克隆胚的研究中表明并且胚胎的发育也有差异在使用先融合后激活(FBA)的方式生产核移植胚胎的过程中去核卵母细胞和重构胚胎均应保持在HSOF或以HSOF为基质的培养液中，以期取得较高的成功率在早期的研究中Campbell等(1996)[4]采取了体内培养技术该方法不仅成本高Wells等人[13]经过技术改良目前与常规胚胎移植相同牛的胚胎移植采用非手术法极大地推动了克隆技术的发展 3.1理论价值 在诞生之前分化了的细胞不具备全能性是不可逆转的过程也就是所谓的细胞分化的不可逆性的诞生确立了新的理论体系一旦条件合适即具全能性[14]²»½öʹÆäѸËÙ³ÉΪÅß̥ѧϸ°ûÉúÎïѧ·Ö×ÓÉúÎïѧ¼°ÉúÎ﹤³ÌѧµÄÖØÒªÑо¿·½·¨Ö®Ò»È·Á¢ÁËеĿÆѧÀíÂÛ3.2实际应用价值 哺乳动物体细胞克隆技术的发展具有一定的实际应用价值通过体细胞克隆技术可提高转基因动物的效率如在1998年5月第二如英国ＰＰＬ公司就曾培育出带有人基因的绵羊可用于囊性纤维变性疾病的治疗动物克隆有利于集约化生产充分发挥动物的生产潜力以满足人们对畜产品的需求体细胞克隆技术与ES细胞培养能迅速提高优良基因及其组合在群体中的频率从而加快育种进程第五保护珍贵的遗传资源Nature Biotechnology上报道了异种体细胞克隆濒危哺乳动物为濒危动物的保护提供了重要的借鉴[15]Ìåϸ°û¿Ë¡¼¼ÊõÓëES技术结合第七从而减小因个体之间遗传背景的差异而导致的系统误差通过（Gene Knock-out)技术打掉猪细胞体内的GT基因可使猪为人类再生组织器官成为可能[16]ÀûÓÃÌåϸ°û¿Ë¡¼¼Êõ¶ÔÈËÀàijЩÍçÖ¢ÈçÅÁ½ðÉ-ÊÏÖ¢²¡ÊµÊ©Ï¸°ûÖÎÁÆÖÎÁÆÐÍ¿Ë¡4 哺乳动物体细胞克隆技术存在的问题 随着哺乳动物体细胞克隆技术的发展猪兔等在最近几年相继诞生体细胞克隆技术也被广泛应用于医学等领域哺乳动物体细胞克隆技术仍有待于完善主要存在以下几个方面的问题需要由分子遗传学细胞学等相关基础学科提供可靠的理论指导与技术支持提高体细胞克隆的成功率如建空中楼阁人们虽然在克隆技术的研究上积累了一定的经验例如MPF核膜破裂和早熟染色体凝集在基因组重构过程中的作用机制尚不清楚动物克隆中的种属及细胞间差异的原因核质比的选择这一系列问题需要细胞学分子遗传学之所以当前体细胞克隆成功率低与体细胞克隆相关的基础学科的研究与发展4.2体细胞克隆技术的程序不够完善 为了提高哺乳动物体细胞克隆的成功率例如用第二次减数分裂中期的卵母细胞取代原核期受精卵作为核受体用电融合法或直接注射法代替病毒融合用较完善的体外培养系统免除中间受体培养过程等等[18]Ìåϸ°û¿Ë¡¼¼Êõ´æÔÚ¼¼ÊõÉϵÄȱÏÝÔÚÈÑÉïµÄÇ°Èý·ÖÖ®Ò»½×¶Î´óÁ¿ËÀÍöWilmut[1] 采用乳腺上皮细胞胎儿成纤维细胞体外培养克隆绵羊５．９％目前还不甚明了胚胎早期死亡的原因也许与受体细胞的去核技术有关或者是兼而有之胎儿或胎盘发育过程某一阶段中基因表达模式不正常有人认为尿囊液过多是造成胚胎早期死亡的原因[13]Ä¿Ç°Éв»Çå³þÅßÌ¥³É»îÂʵÍÖÁÉÙ·´Ó³ÁËÒ»¸öÎÊÌâÔÚÌá¸ßÌåϸ°ûºËÒÆÖ²ÅßÌ¥µÄ³É»îÂÊÎÊÌâÉÏÍêÉÆÆä¼¼Êõ¹æ·¶ÏÔµÃÈÕÒæÖØÒªÔÚÒ»¶¨³Ì¶ÈÉÏ´æÔÚ¼¼ÊõȱÏݵ«¾ÍÆ䷢չǰ¾°¶øÑÔÊ×ÏÈÌá¸ßÐóÇݸöÌåµÄÉú²úÐÔÄܲ¢¼ÓËÙÓÅÁ¼Æ·Öֵķ±ÓýÓÉÓÚijЩ±ôΣÎïÖֵĸöÌåÊýÁ¿ÉÙ¶øÎÞ·¨±£Ö¤´óÁ¿¿Ë¡µÄÐèÒªÁíÍâ将体细胞克隆与转基因技术相结合基因打靶方法与体细胞克隆技术相结合用于人体内衰老或发生病变的器官移植有人利用可能引发的伦理那是很片面的认识能否朝着良性方向发展关键在于人们能否正确而合理的应用它可能引发的一些伦理而与人们利用该技术的动机有关我们不能只凭此消极影响来否定它的应用价值一方面实现更广泛的应用价值呼吁各国政府立法禁止克隆人实验或制定国际公约禁止克隆人造福于人类体细胞克隆技术将会在新的世纪不断完善并得到更为广泛的应用。