检测系统的滞留体积
外体积（Vext）应尽量保持足够的低。这一体积指 的是上游体积（从上样点到柱体之间）和下游体积 （从柱底到检测器）之和。与扩大样品体积的效果 类似，不恰当的检测系统设置也会影响所测试的柱 效柱效 （图 4） 。 因此用于检测的管路应尽可能的短， 并且内径应最小且不会造成过大压降。
不对称性
简化塔板高度
对称性
不对称导电峰 不对称性 UV 峰 流速（cm/h） 流动相电导（Ms/cm）
不对称性 简化塔板高度
图 2.在装填 Sepharose™ XL 评价柱效时流动相电导 对对称性的影响。该柱床的检测样品含 1%的丙酮 和 1 M 的 NaCl（样品体积为 1%柱体积） 。当洗脱 液的电导发生改变时样品浓度保持不变。所有操作 中紫外测定的对称性在 1.2 -1.4 之间。流动相电导 值对电导对称性的测定具有极强的影响。若使用的 洗脱液电导过弱，则会出现一个前倾峰。
*从示踪信号整合中衍生出的停留时间分布（RTD）曲线上 的第一和第二参量。 **达到最大峰高的时间（或洗脱体积）所对应的停留时间 （停留体积） 。
图 1.脉冲检测计算和术语的示意图概况。
通过测定峰宽和对称性简化峰的评价 峰的展宽通常通过塔板数 N 或理论塔板塔 板高度（HETP）进行描述。该概念和多槽 串联模型等价， 反应了平衡阶段层析柱所体 现的塔板数量。 常用的用于评价脉冲检测（确定塔板数量） 的方法包括测定最大峰高一半时的峰宽。 该 方法是数值曲线整合方法的替代。 数值曲线 方法中需要应用参量， 其中第一个参量为平 均保留体积/时间，第二参量为保留体积/时 间的方差。如图 1 所示，将脉冲反应和时间 或洗脱体积进行作图， 同时测定半峰高时的 峰宽，并将其与洗脱时间相关联，或者更适 宜的方式是测定最大峰高处的洗脱体积。 在 最大峰高处测定得到的保留时间和保留体 积与平均停留时间或对称峰（高斯峰）形状 的体积相对应。 折合塔板高度 h 是一个使用方便， 用于定性 描述性能的无量纲参数。 该参数与层析柱长 度和介质的颗粒半径无关， 可以方便地比较 各个层析柱的性能。 测定峰上升和下降 10%处的峰高是简化评 价柱效的一个标准。 柱床装填本身的不均匀 以及管道和柱床外组件内液流不畅都会造 成理想峰对称性（As=1）的偏差。此外，柱 床内进气泡或填料堵塞或者液体流动不均 匀，都可能影响峰的对称性。 最佳柱效 对于生物过程色谱中使用的有孔介质， 其最 佳柱效时实验测定的折合塔板高度 h 小于等 于 3。最佳柱效需要在最佳检测条件下，用 填充良好的柱床以及优化设置好的层析柱 和层析系统进行测定才能获得。实际操作 中，会对可接受的标准进行适当的调整（如 硬件很难得到） 。在过程中采用高流速，在 高通量生产系统下进行操作对于在最佳条 件下进行柱效测试可能并不适合。 根据特定的应用， 最佳柱效测定中适当的偏 差是可以接受的。 为了对包括高分辨的凝胶 过滤和挑战性的精细纯化在内的所有色谱 应用都能有效进行验证， GE Healthcare 提供 了一些推荐方案，旨在获得高效参数。 对称性 就峰的对称性而言，理想对称性为接近 As=1。当工作中折合塔板高度h ≤ 3时，一般 能接受的范围通常在0.8-1.8之间。需要谨记 的是以柱宽而言， 柱效越低通常意味着峰对 称性越好。
图 3. 填充床采用不同流速检测时的折合塔板高度 和对称性。当使用最佳检测流速（20 cm/h）时，折 合塔板高度为 2.3，而流速在 80 cm/h 时，高度增加 100%。 表 1.对所选介质适合的检测速度 颗 粒 大 小 （μm） 15 30 35 介质实例 SOURCE™ 15 SOURCE 30 Sepharose High Performance, Superdex™ Sephacryl™ Sepharose Fast Flow, Capto™, MabSelect™ Sepharose Big Beads 速度（cm/h） 60 60 30
平均停留时间* 方差* 停留时间** 停留体积** 半峰高峰宽 床高 颗粒半径 一个理论塔板的等价高度 折合的塔板高度
脉冲检测
脉冲功能是检测使用的最为常见的信号类 型。 将小体积的示踪物质加入靠近层析柱入 口的液流时， 这一展宽的脉冲信号在层析柱 出口处分析图 1 中给予了总 结。 柱效通常被认为包括两个参数： 整个层析柱的峰展宽情况通常用等价 数量的理论塔板数进行描述（平衡阶 段） 峰对称性通常用峰对称性 As 进行描述。
As=b/a
示踪物质浓度 术语 塔板数
半峰高峰宽 Wh
时间（洗脱体积 V） 停留时间（停留体积） 相对峰宽通常用一定数量的理论塔板（N） ， 一个理论塔板的等价高度（HETP） 或更常用折合了的塔板高度（h）来进行描述： 对称因子 As 描述了与理想高斯峰形状的偏差，通过对 10% 峰高处的峰宽进行计算得到：
柱效检测是示踪物质流经柱床时的保留时 间的分析。 加载于柱子上的典型检测信号通 常是脉冲或阶跃信号。 为了在不干扰的情况 下对层析柱进行分析， 必需对示踪物质和洗 脱条件进行选择， 以避免化学物质与介质发 生相互作用以及干扰液体流动。
N μ1 σ2 tR VR Wh L d/P HETP h=HETP/d/P 对称性 As
液体流速
峰的展宽程度以及导致的色谱的柱效柱效在很大 程度上取决于检测过程中所使用的液体流速。理论 上，峰展宽和液体流速之间的关系可通过范德姆特 方程进行描述（1） ： HETP=A+
B +C×u u
50 75-100
20 20
其中 A 指的是湍流扩散 B 指的是分子扩散 C 指的是传质阻力 u 指的是液体流速（cm/h） 图 3 示实验分析所反应的液体流速对柱效柱效的影 响。当液体流速在 20 cm/h 左右时折合塔板高度最 小且柱性能最大。当速度降低时，由于范德姆特方 程中 B 对应的分子扩散使得柱效柱效有所降低。 在 高检测速度时，由于在层析柱中保留时间缩短，根 据范德姆特方程中 C 代表的粒内扩散受到限制， 导 致峰宽增加。值得一提的是图 3 中的峰的对称性随 液体速度的提高而减小，这主要还是由于建立的检 测方法减小峰的展宽从而影响到对称性（如上所 述） 。 允许标准 h≤ 3 保证了合适液流速度， 从而可以得到 最佳的理论柱效柱效。 颗粒大小 （扩散的特征长度） 是决定最佳流速的主要参数（见表 1） 。
总结
最佳柱效柱效质量认证参数规定如下： 折合塔板高度 h≤3 对称性 0.8 < As < 1.8 这些指标依赖于检测条件和参数优化使用 包括： 不与介质发生相互作用的一种惰性示 踪物质 能发挥最大理论柱效的最佳液体流速 低外体积 脉冲检测的样品体积小（1%柱体积） 实验步骤参考 系统准备 · 首先需要对系统和管道进行润洗准备 · 其次需清除在包装、储存或运输过程中累 积在管道和分流系统中的空气 · 再者，需将层析柱置于 1.5 柱体积以上的 洗脱液中进行平衡。 若柱平衡在盐溶液中 进行， 则需要保证出口的电导和入口的电 导一致。 平衡时的液流方向需与测试时一 致。测试方向既可向上流也可向下流。 运行脉冲柱效检测 将提前准备好的一定体积的样品（1%柱 体积） 加载于柱上， 上样最好采用样品环， 超级容量杯或样品泵。 如果没有这些设备 对样品进行分散处理， 可以在第一步就将 样品加载入系统， 并采用层析柱的旁路模 式进行操作。 在预期的样品体积加载在层 析柱以后，将层析柱切换至旁路模式，使 样品专为洗脱成分， 这些都在最终的实际 脉冲检测之前进行。 无样品环或样品泵条件下逐步进行柱效 检测 1． 将洗脱成分置于系统的一个入口上， 同时 样品放在另一入口。 如果系统具有梯度功 能， 则可选择将样品放置在另一入口， 泵 A 或泵 B。
GE Healthcare 应用手册 28-9372-07 AA 层析柱
柱效检测
固定柱床层析是一种多功能的分离技术， 常 用于生物医药的分离中。 无论是在保证纯化 过程的稳定性还是保证最终产物的安全性 上， 填充柱的制备和质量认证都是极为重要 的步骤。 柱效检测在认证和监测装填柱子效 果方面具有重要的地位。 即使柱效检测不能 作为单一参数对后期的纯度和回收率进行 预测， 至少在启动纯化工艺前可作为一种快 速途径对层析柱和设备性能进行检测。 该项 检测还可用于检查不同运作批次之间柱床 完整性的改变。 该手册对检测原理进行一个 简要的剖析， 并对柱效检测的实验检测操作 进行简要的描述。 为方便开发出稳定的检测 方案，给予了适当的检测条件，并对其中对 检测性能有重要影响的参数进行讨论。 理论背景
200
10
样品体积
通过脉冲实验所进行的柱效柱效测试通常使用的 样品体积为 1%的柱体积（Vc） 。当某些硬件条件无 法满足时，可以在经验范围内进行微小优化以加强 对示踪物质的检测能力。然而，值得一提的是，对 于柱效好的柱子来说增加脉冲实验中样品体积可 能导致色谱峰明显加宽，降低塔板数。这一点对于 小颗粒直径的层析介质而言尤为常见（1） 。由于峰 宽增大，峰对称性可能有所改善。这一点与增加检 测流速的效果类似（见图 3） 。
UNICORN™评价软件的微分函数功能进行 F(t)函 数的计算。以下例子中，阶梯函数通过脉冲函数 E(t)作图。第二步中，计算得到的脉冲函数如图 1 所示进行分析。 实验数据：阶梯函数
计算数据：脉冲函数
图 5. 在转换分析中得到的阶梯函数对柱效 柱效进行评价。 当某些硬件使用受到限制时可通过转换分 析对层析柱进行质量认证。此外，转换分析 还可作为工艺过程中柱效柱效在线监测的 工具（比如后续的步骤电导变化时） 。然而， 为了获得稳定的柱效（如上所述）需要对某 些参数和前提条件进行设定， 如示踪物质的 惰性，流体密度和粘度的稳定性，尤其是体 流速等。最后，通过在线监测获得的柱效数 据和在初始层析柱质量认证过程中通过脉 冲方法获得数据有明显的区别。
然而这样会使得装柱过程的各种缺陷进行 观察和纠正的难度有所增加， 并且会导致层 析柱和层析系统构建不当增多。 适宜检测条件的选择 理论上来说， 生物过程应用中使用有孔层析 介质时，当塔板高度通常在 h=1.5 到 2 之间 时往往能获得最佳柱效。 这套理论柱效是通 过范德姆特分析衍生而出， 反应出最佳检测 环境下（即液体流速）填充床内的对流和扩 散分散效应。 其余的峰扩散来源主要包括了 柱床装填不均一，层析柱液流分布不均匀， 系统效应以及样品体积等因素。 为了给层析 柱设定适宜的参数（也为了解决问题） ，需 要对这些导致峰展宽的原因进行严加控制， 这样才能定义影响理论塔板数柱效的基准。 示踪物质 示踪物质的选择需要保证物质大小（分子 量）能完全渗透进入层析介质的孔隙结构 内。 必须避免示踪物质与层析介质发生表面 相互作用， 以保证示踪物质是化学惰性和稳 定的。此外，洗脱成分和样品的粘度和密度 差异应降低至最小， 以避免由不稳定流动模 式（粘度指纹效应）造成的系统误差。 通常使用的，能符合这些要求的样品/ 洗脱 系统为水-丙酮和盐系统，这些系统可分别 通过测定吸收值和电导进行监测。 根据层析 介质的化学属性，推荐以下样品和洗脱液： 对于除疏水合成聚合物，RPC 和 HIC 介质 以外的所有介质： 洗脱液：水 样品：1 -2% 丙酮水溶液 对 RPC 和 HIC 而言： 洗脱：20%乙醇 样品：1 -2%丙酮，至少 20%的乙醇 对于所有介质： 洗脱：0.4 M NaCl（溶于水） 样品：0.8 M NaCl（溶于水） 当使用 NaCl 作为示踪剂时，洗脱液中至少 要用 0.4 M NaCl（35 – 40 mS/cm）对示踪剂 和层析介质之间的电荷相互作用进行有效 地抑制 （否则可能会导致不恰当的检测结果 发生） 。当时用的示踪物质与介质发生相互 作用时，峰对称性受到破坏，这一例子见图 2