实验六高效液相色谱(HPLC)柱效测定
093858 张亚辉
一. 实验目的
1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。
2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。
3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。
二. 实验原理
高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。
在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。
反之，则称为正相色谱分离系统。
反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。
定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
分离度（R）的计算公式为：
R＝ 2[t
(R2)-t
(R1)
] /1.7*(W
1
＋W
2
)
式中 t
(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t
(R1)
为相邻两峰中前一峰的保留
时间； W
1及W
2
为此相邻两峰的半峰宽。
除另外有规定外，分离度应大于1.5。
本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。
它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。
但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。
待测物性质见表1。
表1色谱柱测试条件
如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂
1、仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。
2、试剂
甲醇（色谱专用），高纯水
四. 实验步骤
1、色谱条件
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8）
柱温：室温
流动相：初始为高纯水：20％，甲醇：80％
检测器：DAD检测器;
检测波长：220nm；
进样体积：20µl定量环，实际注射每次可控制在40µl。
2、待测溶液的配制
首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。
然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。
3、色谱测定
(1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。
流量为1.000ml/min。
(2) 待仪器稳定后，开始进样。
将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液40ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。
(3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。
(4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。
依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。
五.实验结果
（1）梯度洗脱条件如下 t/min 0 2 3 7.5 甲醇比例
80%
80%
95%
80%
R=
][7.1]t t [2)1(21)
2(21)1()2(Y Y R R +-=
)
1026.00970.0(7.1)
202.3792.3(2+⨯-⨯=3.48(注:此处及以下都为第一个
峰和第二个峰的分离度) （2） t/min 0 2 3 7 甲醇比例
80%
82%
100%
80%
R=
][7.1]t t [2)1(21)
2(21)1()2(Y Y R R +-=
)
1046.01002.0(7.1)
585.2241.3(2+⨯-⨯=3.77
t/min 0 2.5 3.5 6 甲醇比例
80%
95%
100%
80%
R=
][7.1]t t [2)1(21)
2(21)1()2(Y Y R R +-=
)
0930.00966.0(7.1)
074.3542.3(2+⨯-⨯=2.90
（4） t/min 0 1 2 6 甲醇比例
80%
95%
100%
80%
R=][7.1]t t [2)1(21)
2(21)1()2(Y Y R R +-=
)
0879.00799.0(7.1)
877.2256.3(2+⨯-⨯=2.59
t/min 0 0.5 1.5 6 甲醇比例
90%
95%
100%
90%
R=
][7.1]t t [2)1(21)
2(21)1()2(Y Y R R +-=
)
0844.01089.0(7.1)
743.2966.2(2+⨯-⨯=1.36<1.5,两峰没完全分离
六. 思考题
（1） 比较图2和图3可知，在缓冲液作流动相的情况下，实验得出的峰形较好。
但为什么实验室尽量不用缓冲溶液作流动相？
图2 缓冲液作流动相得出的色谱图
图3 乙腈-水（5：95）作流动相得出的色谱图
用缓冲溶液作流动相，可能造成色谱柱填料被化学破坏，这种对色谱柱固定相及键合相的破坏通常是不可修复的。
（2）流动相在使用前为什么要用砂芯漏斗过滤？
色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。
仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。
总之，尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
（3）请分析实验结束后，怎样清洗柱子。
分为两种情况，第一种情况为流动相用到缓冲溶液，第二种情况为流动相不用缓冲溶液？
1）对于使用过缓冲液的柱子，必须先将体系中盐分去除干净，然后再以强溶剂清洗。
通常可以同浓度但不含缓冲液成分的流动相洗20倍柱体积，亦可直接以纯水洗至柱内无盐后再改换成强溶剂洗脱。
要确保缓冲溶液与冲洗溶剂互溶。
如果不能互溶，首先要用水含量相对较高的溶剂冲洗系统和色谱柱，然后再用冲洗溶剂替换。
2）对于不用缓冲溶液：以20倍柱体积或更多一些的强溶剂加以清洗。
例如，90%~100%的甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃等。
如果效果不理想，则可换用更强的溶剂清洗，例如，将系统逐步置换至乙酸乙酯、异丙醇、氯仿、烃类（如己烷、庚烷等）。
也可以在甲醇、乙腈等水溶性溶剂之后，改用50%DMSO或DMF水溶液加以清洗。
清洗几十倍柱体积后，再逐步置换返回原系统
（4）根据实验结果分析，流动相中水的比例多少对分离度、出峰时间的影响及流速对分离度的影响。
从五种梯度洗脱条件可以看出，随着水的比例减小，分离度也减小，但出峰时间加快。
所以应选择一个合适的流动相比例。
流速较小，分离度更大，但出峰时间延长。
七、分析与讨论
1.与气相色谱法比较，液相色谱法不受试样挥发度和热稳定性的限制，非
常适合于分离生物大分子，离子性化合物，不稳定的天然产物以及其它各种高分子化合物等。
液相色谱中的流动相不仅起到使试样沿色谱柱移动的作用，而且与固定相一样，与试样发生选择性的相互作用，这就为控制改善分离条件提供了一个额外的可调因素。
2.高效液相色谱法分析速度快、分离能力高，是分离混合阴离子的最有效方法，而且仪器流路采用全塑件，玻璃柱，耐腐蚀。
在环境分析上，应用对象主要是环境样品中各种阴、阳离子的定性、定量分析。
此外，也是食品和饮料中阴阳离子、有机酸、胺和糖类分析的较好方法。