限制性核酸内切酶
• 主要是从 原核生物中分离纯化出来 的一种酶。 • 识别双链DNA 分子的某种 特定的核苷酸序列 ，
• 并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间 磷酸二酯键 断开。 的 • 形成两种末端
粘性末端
平末端
“分子缝合针” —— DNA连接酶 1、种类：
两类
E· coli DNA连接酶
DNA聚合酶的作用
A T A T T A T A G C
DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶
A
A T
T
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课本知识回顾 基因工程又叫做 基因拼接技术 或 DNA重组技术。通俗地说，就 是按照人们的意愿，把一种生物 基因 的某种 提取出来，加以 修饰改造 然后放 ， 到另一种生物的细胞里， 改造生物的遗传性状。 定向地
7
EcoRI限制酶的作用
大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC 序列，并在G和A之间切开。 在G与A之 间切割 中轴线
EcoRI限制酶的切割
黏性末端
被限制酶切开的DNA两条 单链的切口，带有几个伸出的 核苷酸，他们之间正好互补配 对，这样的切口叫黏性末端。
黏性末端
SmaI限制酶的作用
专题1 基因工程
基因工程是指按照人 们的愿望，进行严格 的设计，并通过体外 DNA重组和转基因等技 术，赋予生物以新的 遗传特性，从而创造 出更符合人们需要的 新的生物类型和生物 产，因 此又叫做DNA重组技术。
第1节
安徽省含山中学
王冰
问题探讨
人工改造
的
练习
• 在基因工程中，切割运载体和 含有目的基因的DNA片段，需 使用（ ） A. 同种限制酶 B. 两种限制酶 C. 同种连接酶 D. 两种连接酶
练习
不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 （ D）
D、它是环状DNA
练习
3) 基因工程是在DNA分子水平上进行设计施 工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱 基互补配对的步骤是 （ C） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞
连接黏性末端
T4 DNA连接酶
连接黏性末端和平末端
2、作用部位：
磷酸二酯键
基因进入受体细胞的载体
通常有三种:
质粒 λ 噬菌体衍生物 动植物病毒
作为载体的条件： 能自我复制；有切割位点； 有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离 在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是 在 天然质粒 基础上进行过
手术刀
培育抗虫棉 缝合针 需要哪些基 运输工具 本工具 ?
自主学习
阅读课本4-5页“限制性核酸内切酶——分子 手术刀”的相关内容，填写下表
来源 种类 作用
主要从原核生物中分离纯化而来 已经分离出大约4000种 1、识别双链DNA分子的某种特定核 苷酸序列 2、使每一条链中特定部位的两个核 苷酸之间的磷酸二酯键断开。
SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
在G与C之 间切割
中轴线
SmaI限制酶的切割
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA 两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
平末端
平末端
寻根问底
你能推测限制酶存在于原核生物中的 为什么限制酶不剪切细菌本身的 DNA？ 作用是什么吗？ 通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物 在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机 的细胞，其 DNA分子中不具备这种限制酶 制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细 的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲 菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会 基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶 利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的 不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某 安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切 种限制酶也不会使自身的 DNA 被切断，并 割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的 且可以防止外源 DNA的入侵。 目的。
自主学习
阅读课本第5页“分子缝合针”——DNA连接 酶的相关内容，填写下表
类型
来源
功能
相同点 差别
E· coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复磷 只能连接黏性末端 酸二酯 能连接黏性末端和 T4DNA连接酶 T4噬菌体 键 平末端(效率较低)
DNA连接酶的作用
把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将 脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯 键
载体的种类
②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
最常用运载体——质粒
质粒——裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核
DNA）之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。
有标记基因的存 在，可用含青霉 素的培养基鉴别。
能复制并带着 插入的目的基 因一起复制
有切割位点
实际上在基因 工程操作中， 真正被用作载 体的质粒，都 是在天然质粒 的基础上进行 过人工改造的。
目的基因
GATC— —
自主学习
阅读课本第6页“分子运输车”——运载体 的相关内容，填写下表
1）作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中
载体的作用
2）在受体细胞内对目的基因进行大量复制 1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
载体的必 要条件
2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3）具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。 4）必须是安全的 ，对受体细胞无害。 5）载体DNA 分子应大小适中，以便于提取和操作 ①细菌的质粒
↓
末端。
— GATC —„„— GATC — — CTAG↑—„„— CTAG↑—
↓
目的基因
↓
用酶Ⅱ切割
（3）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形 成的黏性末端能否连接？为什么？ 可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏 性末端是相同的（或是可以互补的）
— GATC—„„— —CTAG —„„—CTAG
作用结 果
形成两种末端：黏性末端或 平末端
脱氧核苷酸的结构
5’ 4’ 3’ 1’ 2’
磷酸二酯键
5’
A
1’
5’端
3’端
4’
3’ 2’
3’,5’-磷 酸二酯 键
5’ 4’ 3’
G
1’ 2’
5’端 3’端
限制酶的识别序列
仔细观察各限制酶 识别的特定序列有 何 特点？
限制酶所识别的序列的特点是： 呈现碱基互补对称，无论是6个 碱基还是4个碱基，都可以找到 一条中心轴线，中轴线两侧的 双链DNA上的碱基是反向对称 重复排列的 ，称为回文序列
形成DNA的一条 链
DNA复制
小试身手
限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制 性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有 酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。 （1）请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。
—G GATC C— 用酶Ⅰ切割 —G GATCC— — C CTAG↑G— （ 2）请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性 —CCTAG G—
DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
DNA连接酶 DNA聚合酶
相 同 点
作用实质
化学本质
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质 不需要 在两个DNA片 段之间形成磷 酸二酯键 需要
只能将单个核苷 酸连接到已有的 DNA片段上，形 成磷酸二酯键
模板 作用对象
不 同 点
作用结果 用途
形成完整的重 组DNA分子 基因工程
DNA连接酶的缝合作用
可把黏性末端之间的 缝隙“缝合”起来， 两DNA片段要具有互补 的黏性末端才能拼起来
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口， 但不能连接单链DNA！
DNA连接酶的缝合作用
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来， 但效率较低
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
D、目的基因的检测和表达
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