大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养
南京军区总院神经内科实验室许丽丽2012年10月
一、试剂
1)Poly-L-lysine（Sigma,P2636）
2)DMEM（Invitrogen,11995-065）
3)FBS（Invitroge,10099-141）
4)Neurobasal（Invitrogen, 21103-049）
5)B27（Invitrogen ,17504-044）
6)GlutaMAX （Invitrogen ,35050-061）
7)HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112）
8)0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056）
9)DPBS（HyClone，SH30028.01B）
10)dd H2O
11)10％水合氯醛
12)75％酒精
二、器械
1)手术器械：组织剪x2、组织镊x1、直弯镊各x1、眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显
微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x1
2)200 ml小烧杯（盛放胎鼠）
3)200目不锈钢筛
4)细胞计数器（求精）
5)50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）
6)6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosrer,3599）
7)直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010）
8)3ml移液管（Biologix, 30-0138A1）
9)过滤器（Millex-GP, SLGP033RB）
10)注射器：50ml、5ml各 1
11)Pipette and pipette tips
12)冰袋、手套、棉球、棉签
Day 1
1、消毒
1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。

1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。

2、包被培养板
2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。

2.2 取PLL，用DPBS将其稀释至100μg/ml。

2.3 以PLL包被培养板，量以覆盖培养板底面为宜。

6孔板：1 ml per well；24孔板：0.5 ml per well；96孔板：0.1 ml per well。

过夜。

3、配置培养基、消化酶
3.1 DMEM with 10% FBS
FBS：DMEM=1：10
取FBS 4ml、DMEM 40ml加入50ml离心管中混合。

3.2 Neurobasal-B27-Glutamine Medium
Neurobasal：B27=50:1
Neurobasal：GlutaMAX =100:1
取Neurobasal 50ml、B27 1ml、GlutaMAX 0.5ml，加入50ml离心管中混合。

3.3 0.125％胰酶
取0.25％Trypsin-EDTA 5ml,用HBSS稀释至10ml。

将配置好的培养基、消化酶放入4°C冰箱中，待第二天使用。

4、消毒
操作台使用完毕后清理垃圾，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30分钟。

Day 2
1、消毒
打开操作台紫外线灯消毒30分钟。

2、洗板
用ddH2O洗涤3 x 5 min，放入培养箱中晾干。

3、解剖孕鼠
3.1 将已消过毒的解剖工具和已乘HBSS的小烧杯端入动物房。

3.2 麻醉：取10％水合氯醛5ml,腹腔注射麻醉孕鼠。

3.3 75％酒精消毒切口部位。

3.4 开腹（尽量开口大一些，便于后面操作）
使用1把组织镊、1把组织剪。

3.5 分离胎囊。

换用另一幅直/弯镊、组织剪。

3.6 将分离出的胎囊放入HBSS中。

4、解剖胎鼠（所有操作在冰袋上进行）
4.1 将盛放胎囊的烧杯放进操作台。

4.2戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。

4.3 取3个培养皿，内乘HBSS，放置在冰袋上。

将胎鼠从胎囊中取出，剪去头，将胎头放入一个培养皿中。

4.5 用两支显微镊撕开脑膜，取出脑组织，将脑组织放入另一乘HBSS的培养皿中（将所有的胎鼠都同样处理）。

4.6 用两支显微镊分离脑膜，尽可能的去掉所有的血管和血管膜，将分离好的脑组织放入另一新的内乘HBSS的培养皿中。

4.7 将分离好的脑膜用虹膜剪剪碎脑组织，约1mm3。

5、接种细胞
5.1 用移液管将剪碎的脑组织移入两个15 ml离心管中。

5.2 每支离心管加入3 ml 0.125％胰酶，摇匀，37℃消化15分钟（为增加接触面积消化更充分可将离心管平放，也可以用60 mm培养皿消化。

）
5.3 消化期间整理操作台。

5.4 消化15分钟后，用移液管移去胰酶，每支离心管加入2 ml 10％ FBS/DMEM终止消化。

5.5 吹打：用1 ml枪头，吹打40次，静止2分钟，将上面液体移入一新的15ml离心管中。

下面沉淀的细胞团块不要丢弃，加入1-1.5ml10％ FBS/DMEM吹打20次，重复上面的步骤。

一共这样分次吹打3次。

3次之后如果还有团块在下面，果断丢弃。

（吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。

吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。

）
5.6 过筛网至60 mm培养皿中。

5.7 将培养皿中液体移入2支15 ml离心管中。

5.8 离心：800转5分钟。

5.9 弃上清，沉淀的细胞加10％FBS/DMEM 3ml重悬，轻柔吹打100次（具体吹打次数据细胞计数时看到的情况而定，若看到大量细胞团，应加大吹打次数）。

5.10 用细胞计数板计数：细胞浓度 = (4个大格细胞总数/4) × 104 /ml
5.11 调浓度，接种。

接种后摇晃培养板摇匀细胞（注意不要圈圈摇晃，圈圈摇晃会导致神经元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生长不均匀。

要左右平行翻转角度，然后前后平行翻转角度）。

具体细胞接种数值：
培养液体积（ml/well）细胞密度（个/ml）总细胞数（个/ well）
6孔板 1.5ml 1x1061x106
96孔板0.1ml 1x1061x105
5.12 两小时后全量换液，换用NB27（应提前放入37℃细胞培养箱中预热半小时）。

换液前轻轻晃动培养板（细胞碎片贴壁很慢而且不牢固，这时候的摇晃可以最大程度去掉细胞碎片。

）
6、消毒
实验结束后清理垃圾，清洗器械，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30分钟。

7、换液
细胞培养成功后每天观察细胞生长状态，每 3天1/3量或半量换液。

注意：换液前要将NB27放入37℃细胞培养箱中预热半小时。