生物显微技术第一章1、生物显微技术：是应用各种光学显微镜或电子显微镜观察和辨认微小生物（动物、植物和微生物）的细胞形态及其显微、亚显微结构，也包括植物染色体技术与原位杂交等新的方法和技术。

2、列文虎克发明显微镜。

罗伯特胡克用自己设计与制造的显微镜（放大倍数为40-140倍)观察了软木（栎树皮)的薄片，第一次描述了植物细胞的构造，并首次用拉丁文cellar（小室)这个词来称呼他所看到的类似蜂巢的极小的封闭状小室（实际上只是观察到到纤维质的细胞壁)。

第二章1、材料采集注意事项：①选择新鲜的、健康的、有代表性的实验材料；②在保证材料完整的条件下，注意实验材料要“精而小”，而不是“大而多”；③注意实验材料的生长季节和发育时期；④选用刀刃锋利的刀片，切割时用力应均匀，避免组织破裂，影响制片效果；⑤实验材料选好后，应在极短的时间内杀死和固定。

2、切取纵切面时应注意使刀的切向与根茎的长轴方向平行。

这种切面分为两种①、径切面②、切向切面（弦切面）3、固定：应用某种方法以最快的速度，将生物细胞或组织杀死，投入某类化学药液中，借助化学药品的作用使细胞组织保持原来的形状与结构。

4、固定时的注意事项：①材料新鲜：组织采集与分割后须立即固定。

否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。

一般以神经、造血组织自溶速度较快，胰腺、胃肠道的粘膜亦较易发生改变。

②防止变形：对一些柔嫩或薄的材料如神经、肠系膜等，应先平铺于吸水纸上再固定，可防止因蛋白质凝固而引起的扭转变形。

对含气而浮于液体表面的组织如肺等，可缚以重物使其下沉，或吸出肺内气体，使其下沉于固定剂内。

③固定剂用量：一般为组织体积的10~20倍。

避免组织内水分在固定时渗出，影响固定剂的浓度。

勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。

在平时往往用棉花垫以瓶底，而使固定剂能均匀地渗入。

④固定时间：根据组织的不同种类、性质、大小，固定剂种类、性质、渗透力的强弱而定。

有的需要1~2h至10~20h，有的长达几天。

一些小的材料，仅需几十分钟。

某些固定剂（如Carnoy）对组织的硬化作用较强，固定时间不宜过长；但有些固定剂（如Bouin）固定时间稍长也无关系，一般固定24h左右即可。

固定时间的长短与温度也有密切关系。

增加温度虽可缩短固定时问，但对组织变化较大，一般并不采用。

⑤避免阳光：尽可能避免接触阳光以免引起化学变化失去固定作用。

⑥加速固定：轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗入。

5、冲洗：用洗涤剂渗透到材料组织中去，把固定液洗掉。

常用的冲洗剂：水、低浓度的酒精等6、脱水：用一种药剂把材料中的水分全部去除干净。

其目的是在组织中的水分完全去净后便于透明剂的透入。

常用的脱水剂：酒精、正丁醇、叔丁醇、丙酮、甘油7、透明：是采用苯类有机溶剂，将组织或切片中的水溶剂取代，并达到透明的目的。

分为包埋前的透明和封藏前的透明。

常用透明剂：二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油、丁香油等8、包埋：将融化后的包埋剂连同浸透包埋剂的材料一同倾倒于特质的容器内的过程。

常用的包埋剂：石蜡、火棉胶。

9、粘片：切好的切片经显微镜检查合格后，即可用粘贴剂将切好的切片粘贴在载玻片上。

常用粘片剂：明胶粘片剂，蛋白粘片剂，火棉胶粘片剂10、染色：11、染色剂分类：（根据化学性质分）①碱性染料此类染料具有一种有色的有机盐基，能与无色的醋酸盐、氯化盐或硫酸根等结合，一般能溶于水和酒精，如蕃红及苏木精②酸性染料此类染料具有通常为钠和钾的金属基，能与一种有色的有机酸根结合。

也能溶于水及酒精，如固绿、曙红等③中性染料由酸性染料和碱性染料结合而成，也可称为复合染料。

这类染料中，阴阳离子都各有一个发色团，也能溶于酒精和水，如吉姆萨。

12、封藏：将已经过染色、脱水、透明的材料，将用某种具有较大粘性，而且透明度较高、折光率大的溶剂进行封藏，制作成永久切片。

13、封藏剂：水溶性封藏剂：水及甘油、甘油明胶、糖浆脂溶性封藏剂：加拿大树胶、合成树胶第三章一、生物显微制片方法：切片法，非切片制片法二、1、徒手切片：用手直接握住小刀，把选取的材料切成适用于显微镜观察的薄片。

2、徒手切片常用器具：①培养皿：盛清水及放切片用；②切片刀：刀口非常锋利的单面刀片或剃刀；③夹持物：选用软硬适当的物体，例如：向日葵的髓、萝卜或胡萝卜的圆锥根、马铃薯的块茎等。

（有些较小或柔软多汁的制片材料，直接用手夹持切片比较困难，则可把夹持材料在夹持物中进行切片，这样在切片时，材料就不致弯曲，压坏或破裂，而能切出较完整的切片）3、徒手切片方法：①取材：一般选择正常、软硬适中的植物器官或组织为材料，所取的新鲜材料应及时放入水中，以免徒手切片时萎蔫。

②切片：Ⅰ把欲切的材料削成大小适宜的段块，并将切面削平，然后将材料和刀片蘸水湿润。

Ⅱ用左手的拇指、食指和中指夹住材料。

为防止切片时割伤手指，应使材料上端（切面）略高与食指，拇指略低于食指。

用右手的拇指和食指捏住刀片一端，置于右手食指之上，刀片和材料切面平行，刀刃放在材料左前方稍低于材料断面的位置。

Ⅲ以均匀的力量和平稳的动作使刀刃自左前方向右后方斜滑拉切，注意不要直切，中途不停顿，拉切速度要快，不要推前拖后（拉锯式）切割，左手食指向下稍微移动，使材料略有上升，从而调动每张切片的厚度。

切片过程中右手不动，只是右臂移动，动作用臂力而不用腕力。

Ⅳ切片要薄、平而完整，将切下的切片用毛笔刷蘸水从刀片上轻轻移入培养皿的清水中或直接将刀片浸没于水中使切片漂洗下来。

③选片三、1、石蜡切片：用石蜡将处理的材料经浸透、包埋、切片，制成玻片标本的方法。

❖优点：操作比较容易，能切成很薄的连续切片。

❖缺点：脱水和浸蜡后组织容易收缩，坚硬易碎的和易变脆的材料以及较大的材料块不适合制作石蜡切片。

2、石蜡切片常用器具及药品：固定液、染色剂、各级酒精（用于脱水）、二甲苯（用于透明）、石蜡、粘片剂、单面保安刀片（用于修蜡块）、包埋台、烫板、旋转式切片机、刀片（用于切片）、毛笔。

3、石蜡切片法的一般流程为：取材→固定→抽气→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→粘片→染色→封片。

⑴、取材用锋利的刀片切取新鲜的植物材料，选定适宜的材料，立即固定。

取材的注意事项如下：✧取材料要新鲜。

动作要迅速，以免挤压损坏组织；取病理材料时，应设置对照材料。

✧所取材料大小要适当：根和茎一般直径≤5mm，切取成5-10mm小段；叶片一般取过中脉处，切成2-5mm宽、5-8mm长。

在切材料时，必须注意刀片与中轴成直角，两切面平行，否则制成的切片细胞是斜的。

雌、雄蕊一般不需分割。

✧取材时间可根据切片要求有所区别。

如：在进行植物发育的研究过程时，需要找到细胞分裂相，一般在晴天的早晨9：00-10：00时取材，此时植物细胞分裂活动较明显。

✧取材不易过老，否则制片有难度（过老的材料须在滑走切片机上进行）；对纵切的材料适当多取材，如根尖、茎尖等，因为切到材料正中的概率较低。

⑵、固定❖将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中。

借助固定液的作用，使细胞的新陈代谢瞬时停止，并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化。

从而达到使组织变硬从而便于切片、增强内含物的折光度、令细胞易于着色的目的，同时具有防腐作用。

以新鲜配制固定液效果较好。

固定的时间依材料的种类、性质、大小等而定。

材料固定完毕，保存于加盖的容器内，贴上标签。

❖良好的固定剂，应是穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固；不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色。

常用固定液：（简单固定液）➢乙醇为凝固型固定剂。

常用无水乙醇或95％乙醇。

➢甲醛为非凝固性固定剂。

具强烈刺激性气味。

纯净的甲醛为无色透明液体。

固定用的浓度为4%-10％。

➢醋酸为凝固型固定剂。

为无色透明的液体，刺激性极强，低温下凝结成冰，故又名冰醋酸。

⑶、抽气❖植物材料内部多由于含有空气，导致固定液不能完全深入。

材料投入固定液后需要立即进行抽气。

以便让固定液有效透入材料组织中，并排除材料内气泡的干扰。

❖一般抽气时间为20-30 min。

抽过气的材料在停止抽气，应沉入底部。

⑷、洗涤固定液中的成分有可能会妨碍染色或发生沉淀或结晶，影响观察；有的还会继续作用，使材料变质等。

因此，在使用材料时，需根据固定液的种类，用水、缓冲液或70%乙醇洗去渗入细胞内部的固定液。

⑸、脱水❖材料经洗涤后含有部分水分，会使材料分解。

而且透明剂与水是不相混合的，不利于材料的透明和包埋等后期处理。

因此需用脱水剂逐渐除去材料中的水分，以便让石蜡渗透进细胞。

所以，脱水是制片的关键环节。

脱水剂要求能与水混合，而且能与其他有机溶剂互相替代。

❖脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行，防止吸收空气中的水分；在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料，以免损坏材料。

⑹、透明❖透明剂要具有既能与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质，可以将材料中的脱水剂置换出来，使石蜡能顺利进入材料中。

❖二甲苯是目前应用最广的透明剂，作用迅速，但易使材料变脆。

⑺、浸蜡❖是指逐步清除材料中的透明剂，以使石蜡充分渗透于材料内部的过程。

这样，材料的各部分都能保持原来的结构与位置，切片不致发生破裂或其他变形。

❖浸蜡是一个渐进的过程，常用的正丁醇❖每次浸蜡的时间，视材料大小而调节。

⑻、包埋❖材料经过足够时间的浸蜡后，需包入蜡块，以备切片。

❖操作方法：根据切片材料大小，确定所需纸盒的尺寸，用表面光滑的磅纸预先叠好纸盒。

⑼、修整和固定蜡块✧修整蜡块：切去组织周围过多的石蜡，一般情况下在组织周围留有约1~2mm的石蜡边，两边必须平行。

✧蜡块固定：修整好的蜡块先固定在事先准备好的小方木块或者金属块上，固定方法是把蜡铲先在酒精灯上加热，再将蜡块底部烙熔，迅速烙粘在小方木块或金属块底座上。

⑽、切片❖即将包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带。

❖切片前的准备工具：切片刀、酒精灯、烫蜡铲、木块、垫桌纸、火柴、毛笔、镊子、染色架、切片机、小木板，等。

⑾、贴片和烘片❖是用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上，以便于染色和观察。

❖常用的粘片剂有下列二种：(1) 明胶黏片剂(2) 蛋清黏片剂❖烘片方法：（1）烫片台法（2）温水捞取法⑿、染色即根据植物细胞中不同的化学性质，用染料分别进行染色，以利于观察切片中细胞与组织的形态与构造及其内含物等。

染色基本的程序为脱蜡、染色、分色封片。

⒀、封藏❖封藏于中性树胶中，使材料能在显微镜下清晰地显示出来，并能长期保存。

❖方法：将含材料的载玻片放在吸水纸上（切片一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（必须在二甲苯干燥前进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触，然后再缓慢地放下，避免产生气泡。

4、石蜡切片中的常见问题三、1、冰冻切片：将已固定或新鲜的组织块不经脱水而先进性冰冻，然后在切片机上进行切片的一种方法。