阿托品与乙酰胆碱对豚鼠离体肠平滑肌的作用
及PA2、PD2测定
年级：2006年药学专业
学生：苏鹤桂
学号：2006038068
【实验目的】
通过离体器官实验，观察药物对M胆碱受体的激动作用和竞争性拮抗作用，加深理解受体的亲和力、内在活性概念以及受体动力学参数K D、pD2、Emax及pA2的计算和意义。
【实验意义】
1 建立方法研究药物拮抗作用
2 观察药物的拮抗性作用
【实验原理】
M胆碱受体激动药卡巴胆碱能剂量依赖性地激动肠管平滑肌上的M胆碱胆碱受体，产生平滑肌收缩效应，M胆碱受体阻断药阿托品可竞争性拮抗卡巴胆碱对M胆碱受体的激动作用。
通过累积剂量效应曲线，以及曲线直线化方法，可求得受体动力学常用参数。
实验材料
乙酰胆碱（mol/L）：10-6、10-5、10-4、10-3、10-2
阿托品（mol/L）：3 10-7
台氏液配制 1000ml台氏液含：NaCl 8.0g、10% KCl 2.0ml(0.2g)、10% MgSO4.7H2O 2.6ml(0.26g)、5% NaH2PO4 .2 H2O 1.3ml(0.065g)、NaHCO3 1.0g、1M CaCL2 1.8ml（0.2g）、葡萄糖 1.0g。
离体器官浴池及恒温装置、PowerLab系统、混合气体（95％O2＋5％CO2）、负荷500 mg、加液器、培养皿、缝针、线、眼科镊子、剪刀。
【实验步骤】
1．离体肠肌的制备
猛击豚鼠头部至昏，立即剖开腹腔，自幽门下5cm剪取空肠和回肠上段，迅速置于台氏液液中。
小心剪去肠系膜，用吸管吸取台氏液液缓慢冲洗肠内容物；将空肠段分割成2 cm的小段备用，然后用缝针在肠段两端各穿一根线，作为固定肠肌之用。
2．实验装置
将制成的标本一端固定于通气钩上，另一端连接于肌力换能器并接入PowerLab系统的桥式放大器上，浴池内放20ml 台氏液液，加500mg负荷，恒温37±1︒C，浴池内持续通入95％O2与5％CO2的混合气体。
3．累积剂量－效应曲线的制作
实验装置完毕以后，打开PowerLab系统，按“操作指南”设置参数：
（1）选择channel 1
（2）记录速度10 /s
（3）Bridge Amplifer中“rang”选择20 mv，“Low Pass”选择50 Hz
（4）调零“zero”
描记肠肌收缩曲线，待收缩基线平稳后，按下列（表6-2）次序在浴池中加入预先配好的不同分子浓度的乙酰胆碱。
表6-2 累积剂量法加药顺序
秒钟肠肌的收缩达高峰。
应在高峰未下降前，迅速加入下一个剂量。
当反应到一定高峰，再递增剂量，效应不再增加，此时的效应为最大效应。
4．阿托品拮抗乙酰胆碱的剂量－效应曲线的制作
放去浴池中的液体，用台氏液液冲洗三次，以后每隔10min 冲洗一次，共冲洗三次，再加入台氏液液至20ml 。
待收缩基线平稳后，加入阿托品3X10－7 mol/L 0.2ml ，培育15min ，再按“方法3”依次加入不同浓度的乙酰胆碱，便可得到有拮抗剂时乙酰胆碱的累积剂量效应曲线，此时拮抗剂（阿托品）摩尔浓度的负对数即pA x 。
【统计与处理】
1．绘制累积剂量效应曲线
取方格纸，以肠肌收缩幅度（mv ）作为纵坐标即效应（E ），以药物对数浓度（lg C ）为横坐标，绘制量效曲线。
K D 值即达到50％最大效应时，在横坐标上所对应的药物浓度。
药物的最大效应（Emax ）即曲线的高度。
当比较同类药物的Emax 时，即比较曲线的高度（肠肌收缩最大幅度）。
2．直线回归（LR ）计算参数
为了正确求得各参数，必须将曲线直线化。
可按D/R 式（改良Lineweaver －Burk 式）使剂量效应曲线直线化。
(y) (a) (b) (x)
式中：D 为药物剂量（浓度），E 为某一剂量的效应，K D 为药物的解离常数，Emax 为药物的最大效应。
以[D]/E 为纵坐标，[D]为横坐标进行直线回归。
按直线公式y = a + bx ，则
－Log K D 即pD 2
][1
][m ax
m ax D E E K E D D +=max
E K a D
=
截距max
1E b =
斜率D D K E E K b a
=⨯=max max
根据公式pA 2 = pA x + log (x-1)，式中pA x 为拮抗剂摩尔浓度的负对数，x 为用拮抗剂后与用拮抗剂前K D 之比。
【实验结果】
C(mol/l)
lgc
E （乙酰
胆碱)
E(乙酰
-1.95） E （+阿托品)
E2（阿托品
-1.12）
C/E(乙酰胆碱
-1.95）
C/E2（+阿托品
-1.12）
10-5
-5 3.37 1.42 1.47 0.35 7.04X10-6 2.86X10-5 3X10-5 -4.5 3.62 1.67 1.61 0.49 1.79X10-5 6.12X10-5 10-4 -4 4.15 2.2 1.72 0.6 4.54X10-5 1.67X10-4 3X10-4 -3.5 5.07 2.8 2.26 1.14 1.07X10-4 2.63X10-4 10-3 -3 5.36 3.41 3.34 2.22 2.93X10-4 4.50X10-4 0.003 -2.5 5.69 3.74 3.9 2.78 8.02X10-4 0.0011 0.01 -2 5.86 4.01 4.3 3.18 2.49X10-3 0.0031 0.03 -1.5 6.03 4.1 4.92 3.8 7.32X10-3
0.0079 0.1 -1 5.92 3.97 5.45 4.33 0.025 0.023 0.3
-0.5
5.66 3.71 5.51 4.39
0.081 0.068
A B E KD
乙酰胆碱 3.45X10-5
0.268 3.72 1.29X10-4 阿托品 3.68X10-4
0.227
4.41
0.00162 X 12.61 PAX 7.52 PA2
8.59
PD2
2.79
b
E 1m ax
图1
【注意事项】
（1）悬挂肠管时，不要过度牵拉肠管，肠管及连线勿紧贴浴管壁。
（2）加药时不要将药液滴在连线上，应直接滴在液面上。
（3）水浴箱应保持在37±1︒C，浴池内营养液的容积在洗涤标本前后要保持一致。
（4）为了正确地制作累积剂量反应曲线，应在对某剂量的反应到最大后立即给予下一个剂量，但若前一个剂量达到最大反应后慢慢观察再加下一个剂量，则反应曲线难予累积，故可稍微提前一点加入下一个剂量。
【分析讨论】
从图1量效曲线图可见，乙酰胆碱随着给药剂量的增大，肠管平滑肌收缩曲线上升的幅度越大。
说明乙酰胆碱有明显的兴奋肠平滑肌作用．且量效呈正相关性。
阿托品同样随着浓度升高，拮抗性作用也明显增强。
图1还显示，乙酰胆碱与阿托品注射液使肠管平滑肌收缩幅度的下降值为纵坐标，对数剂量为横坐标都呈S 形量效曲线，两者对肠道兴奋与抑制作用统计学分析无显著性差异。
从表格的PA2,PD2值可知，PA2为阿托品竞争性拮抗强度指标，其值越大说明拮抗性越强，PD2为乙酰胆碱受体亲和力的定量，其值越大说明乙酰胆碱亲和性越强。
【总结】
从实验数据可知，乙酰胆碱对肠道具有亲和性作用，其产生的张力效应随浓度增加而增加。
阿托品对肠道具有拮抗性，高浓度阿托品拮抗性越强。
两者的量效曲线显示出它们对肠道不同程度的收缩或兴奋作用；阿托品竞争性拮抗强度指标PA2与阿托品浓度呈正相关，PA2越大说明阿托品拮抗性越强，而乙酰胆碱受体亲和力的定量表示PD2随浓度增加呈上升趋势，表示其对受体亲和力越大。
乙酰胆碱对胃肠道药理作用
ACh可明显兴奋胃肠道，使其收缩幅度、张力增加，胃、肠平滑肌蠕动增加，并可促进胃、肠分泌，导致恶心、嗳气、呕吐、腹痛及排便等症状。
阿托品对胃肠道药理作用
阿托品能松弛许多内脏平滑肌，对过度活动或痉挛的内脏平滑肌，松弛作用较显著。
它可抑制胃肠道平滑肌的强烈痉挛，降低蠕动的幅度和频率，缓解胃肠绞痛；对膀胱逼尿肌也有解痉作用；但对胆管、输尿管和支气管的解痉作用较弱。
胃肠道括约肌的反应主要取决于括约肌的机能状态。
例如胃幽门括约肌痉挛时，阿托品具有松弛作用，但作用不显著和不恒定。
阿托品对子宫平滑肌影响较小。
存在问题：本实验采用的是豚鼠肠道进行实验，影响因素很多，如水浴箱温度，肠道活性，仪器灵敏度，操作不规范等等，所得数据有些偏差。
改进方法：遵守实验室操作规范，掌握仪器使用方法，熟悉实验操作。