革兰染色
革兰染色原理
通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

革兰染色步骤及结果
1. 涂片：首先在载玻片上滴一小滴蒸馏水，用灼烧过的接种针挑取少量细菌，置载玻片的水滴中与水混合并涂抹开，注意涂抹要均匀平坦，涂抹后直径约为1 cm的薄层。

2.固定：将载玻片在火焰上方快速来回通过一两次，以载玻片的加热面接触手背皮肤，不觉过烫为佳，待冷却后再在火焰上方来回通过一两次，再冷却，这样重复操作直到薄层干了为止。

3.染色：在制好的片上滴一滴草酸铵结晶紫，染色1 min后用水洗，注意水流不要直接对准薄层。

4.媒染：加碘液一滴，染1 min后用水冲洗，用过滤纸吸干。

5.脱色：用95%乙醇脱色，一般脱色时间大概为30 s。

这一步是革兰氏染色的关键，必须严格掌握好，如果脱色时间过长则会把阳性菌误认为阴性菌；如果脱色不够则容易被误认为是阳性菌。

水洗后用过滤纸吸干。

6.复染：滴加番红染色液一滴，染色10～30 s后，用自来水冲洗。

7.观察：干燥后，用油镜镜检观察，染成紫色的是革兰阳性菌，染成红色的是革兰阴性菌。

革兰染色的意义
1.鉴别细菌:用此染色法可将所有细菌分为两大类，便于初步识别细菌，缩小检查范围，并确定进一步的鉴定方法。

2.选择药物:革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在细胞壁等结构上有很大差别,因而对抗菌素等药物的敏感性不同，如大多数革兰阳性菌对青霉素、红霉素、头孢菌素等敏感；而大多数革兰阴性菌对链霉素、氯霉素、庆大霉素等敏感。

可供临床实践中选用抗菌药物的参考.
3.与致病性的关系:大多数革兰氏阳性菌的致病物质主要为外毒素;而大多数革兰氏阴性菌的致病物质主要为内毒素.
革兰染色的影响因素
1. 涂片太厚在涂片时细菌挑的太多，没法分开，在脱色时就不能将第一步染上的结晶紫的颜色脱去，可能会使革兰阴性菌也出现紫色，误认为革兰阳性菌。

2.脱色时间阳性菌透性小，不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色；但这是在固定的时间条件下的结果，如果延长脱色时间，也会使脱色剂渗透进阳性菌的细胞壁中，使染上的结晶紫脱去颜色，最后染上复红的颜色，变成革兰阴性菌。

而脱色时间太短的话又会使阴性菌染上的结晶紫不能完全脱色，出现紫色，误认为革兰阳性菌。

3. 固定方法固定不仅能杀死细菌，改变细菌对染料的通透性，还能使细菌吸附在玻片上，保持原有的形态结构。

固定方法是将干燥后的细菌涂片以中等速度通过火焰三次，以玻片触及手背皮肤热而不烫为宜。

如果玻片在火焰上烤的太久、温度过高，改变了细菌原有的通透性，会使细菌的染色性发生变化。

影响了染色的结果。

4. 细菌培养时间细菌的典型形态、染色性是在对数生长期，取这时的细菌做革兰染色可以反应细菌的真实的染色性。

如果细菌培养时间太长，变成了老龄菌，
染色性就会发生变化，可能会使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。

5. 碘液碘液作为媒染剂能增加染料与被染物的亲和力。

如果碘液放置时间太长，或经日光照射失效，失去媒染剂的作用，就可能使结晶紫与细菌结合的不牢固，容易被脱色，使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。