附件：
新菌株（乳酸菌）斜面培养法
1.购买新菌株（安瓿瓶装冻干粉）
2.菌种管开启方法一：按购买菌种上的说明进行操作即可。

3.菌种管开启方法二（本次实验方法均在水平层流台进行）：
3.1水平层流台开启风机跟紫外灯，半个小时
3.2 用浸过75 ％酒精的脱脂棉擦净菌种管。

3.3将菌种管顶端在火焰上加热，注意避免直接加热菌体或加热过度。

3.4 将无菌水滴至加热过的菌种管顶端，使玻璃开裂。

3.5 用锉刀或镊子敲下已开裂的菌种管的顶端。

4.用玻璃三角瓶121.0℃灭菌约10-30ml的生理盐水20分钟
5.将开封后的冻干粉倒入生理盐水中，摇匀
6.用接种环沾取生理盐水，转接与MRS培养基平板上，在36.5℃中恒温培养48-72小时
后，得到二代菌。

7.此时可以使用二代菌进行菌株扩大培养，或对其进行保存菌种。

注意事项：
1 菌种活化前，请将冻干菌种管冷藏保存在5 ℃-10 ℃环境下。

3 菌种经过冷冻干燥后，生长延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长。

4 菌种活化及使用过程应做好安全防护工作。

第二代第2 代)观察是否具有典型的菌落形态,然后挑取单一的纯菌落,进行革兰染色、镜检,观察其染色特征及菌体形态,并进一步做生化鉴定实验以确定菌种。

第三代为工作用菌。

乳酸菌菌种保存法
方法一：斜面保存法（略）
方法二：20%甘油保存法
器材：冻存盒、冻存管(2ml装)、甘油（丙三醇）、MRS肉汤培养基、1ml移液器及枪头、酒精灯、水平层流台、高压灭菌锅
操作步骤：
1.在水平层流台中用接种环挑取所需保存的的菌株放于灭菌过的MRS肉汤培养液，进行
36.5℃恒温培养48小时
2.配制40%的甘油，用移液器移取0.5ml于冻存管中，放于冻存盒
3.用报纸将冻存盒包扎好，放于灭菌锅中灭菌（121.0℃、20Min）
4.在水平层流台中，用移液器移取0.5ml培养后的MRS肉汤培养液加入到冻存管中，拧
紧盖子，摇匀，标识。

5.在冻存盒外也做好操作人，日期，所保存的菌种等信息标记
6.将冻存盒放于保鲜袋中，放入冰箱的冷冻室层进行保存，一般可以保存至两三年。

7.若是需用，那一冻存管样进行培养即可。

实验室菌种激活方法
1.配制少量的液体MRS培养液（约50ml），灭菌后，冷却后，在水平层流台里，倒
入一管冻存管菌种，摇匀，置于36.5℃恒温培养一到两天，然后用此培养液划平板，再从平板里挑单菌落，即可。