CN104017760A [中文]CN104017760A [英文]权利要求书1.一株γ-聚谷氨酸产生菌，其特征在于：所述γ-聚谷氨酸产生菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），保藏号为CGMCC NO.9169。

2..如权利要求1所述的一株γ-聚谷氨酸产生菌的发酵产物在土壤保水中的应用。

说明书一株γ-聚谷氨酸产生菌及其发酵产物的应用技术领域本发明属于微生物和发酵技术领域，具体涉及一种γ-聚谷氨酸产生菌及其发酵产物在土壤保水中的应用。

背景技术农业生产中常存在土壤因保水性差而引起作物缺水，造成减产甚至绝收，因此农业保水对农业生产尤其重要。

目前有一些聚丙烯酸系列吸水树脂材料应用于农业保水，但存在成本高、降解慢、对环境不友好等问题。

因此具有无残留、不污染环境、绿色环保性能的新型保水剂成为当前研究的热点。

由于γ-聚谷氨酸具有水溶性好、保湿性佳、可生物降解等特性，因此在农业上极具应用潜力。

γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，简称γ-PGA)是一种可由多种微生物发酵产生的氨基酸聚合物。

目前研究较多的γ-PGA产生菌有Bacillus Subtilis IFO3335、Bacillus Subtilis TAM-4、Bacillus Licheniformis WBL-3及Bacillus SP.B53等。

在发酵产物保水性方面有研究表明γ-PGA的最大自然吸水倍数可达到1108.4倍，高于聚丙烯酸盐类吸水树脂1倍以上，张新民等制备γ-PGA高吸水树脂最高吸水率可达1600 g/g。

前人研究多侧重于γ-PGA产生菌的选育鉴定、培养条件或发酵产物的鉴定及其保水性中的单一方面，而围绕一株γ-PGA产生菌的选育鉴定并开展培养条件及其发酵产物在土壤保水性等方面的综合性研究报道甚少。

发明内容本发明的目的是提供一株γ-PGA产生菌及其发酵产物在土壤保水中的应用，具有较好的保水效果。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种γ-聚谷氨酸产生菌Dou-6，分类命名：地衣芽孢杆菌，拉丁文学名：Bacillus licheniformis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号，保藏日期：2014年05月16日，保藏号为CGMCC NO.9169。

所述的γ-聚谷氨酸产生菌的发酵产物在土壤保水中的应用。

本发明的有益效果：本发明的γ-聚谷氨酸产生菌的出发菌株Bacillus licheniformis Dou-6所用发酵底物中谷氨酸钠添加量仅为30g/L，在没有进一步发酵培养基及发酵条件优化的条件下，底物中谷氨酸转化率达到60%以上，本发明获得的γ-PGA合成菌株合成效率较高，且该菌株的产量随着传代产量递增加了98.7%，还有进一步增加的可能，有研究通过射线诱变合成菌株后经一定程度的培养基优化，其产能提升了70%以上，因此通过菌株改造或发酵条件优化预期将获得更高的产量；菌株发酵液直接用做土壤保水剂，且表现较好的保水效果，通过直接稀释菌株Bacillus licheniformis Dou-6的发酵液对土壤的保水效果，表明2倍和5倍稀释液均显著起到保水效果，二者达到差异显著水平, 在播种、拌种、移苗时经过γ-PGA保水剂拌种、蘸根处理，就能大大提升其成活率，有广阔的应用前景。

附图说明图1为菌株D3、D4和D6发酵水解物10倍稀释液纸层析（2、4、6、8、10、20分别指2、4、6、8、10、20mg/L谷氨酸标准品）。

图2为标准谷氨酸色谱图。

图3为Dou-6发酵产物液相色谱图。

图4为Dou-6菌株形态图。

图5为Dou-6菌株染色镜检图。

图6为不同培养基中菌株Dou-6的生长曲线。

图7为传代培养对Dou-6菌株聚谷氨酸合成产量的影响。

图8为Dou-6菌株基于16S rDNA序列的系统发育树。

图9为Dou-6菌株的发酵产物不同处理的土壤保水效果。

具体实施方式一种γ-聚谷氨酸产生菌Dou-6，分类命名：地衣芽孢杆菌，拉丁文学名：Bacillus licheniformis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号，保藏日期：2014年05月16日，保藏号为CGMCC NO.9169。

γ-聚谷氨酸产生菌的选育方法，步骤如下：（1）将2g取自河南省通许县玉皇庙乡申店村的豆酱样品研碎悬浮在无菌蒸馏水中震荡均匀，煮沸15 min，冷却后梯度稀释，并涂布于筛选培养基中，37℃下培养24 h，得到菌落，筛选培养基为LB固体培养基（g/L）的组成为: 葡萄糖10，蛋白胨10，NaCl 5.0，琼脂20，pH=7.0；（2）挑选形态各异、生长旺盛、表面光滑且粘稠的菌落8株，相同的培养条件下，将这几株菌进行反复划线培养三次以上，以获得纯菌株；（3）将纯化后的菌株接种到含50ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中，在恒温摇床上培养60 h，恒温摇床的温度为37℃，转速200 r/min，发酵培养基（g/L）的组成为：柠檬酸12，甘油 80，NH4Cl 7.0，谷氨酸钠 30，K2HPO4。

3H2O 0.5，FeCl3.6H2O 0.05，CaCl2.2H2O 0.15，MgSO4.7H2O 0.5，MnSO4.H2O 0.1，pH=7.0；（4）选择粘稠度较高的第2、第6和第7号菌的发酵液于8000 r/min离心10 min，上清液用4倍乙醇沉淀过夜，再于8000 r/min离心l0 min 将沉淀物溶于去离子水中，并透析过夜，将透析液冻干称重，得到γ-PGA的含量，量取纯化好的γ-PGA溶液10 mL，放入水解管，加入10 mL 6 mol/L的HCl，抽真空封口，120℃水解24 h，获得γ-PGA水解产物；（5）用谷氨酸标准品做对照，通过纸层析法检测水解产物中的氨基酸迁移特征，根据各菌株发酵液粘稠度及纸层析结果如图1所示，从图谱上可以看出谷氨酸标准品2、4、8、10、20mg/L与其它三种菌株发酵产物的稀释液基本上处于同一位置，且均只有一个斑点，初步认为3株菌株发酵水解产物是谷氨酸，其中，以菌株Dou-6斑点最亮，结合其发酵液粘稠度，初步判断其γ-PGA合成能力最强，选择第6号菌作为出发菌株，命名为Dou-6。

将Dou-6发酵水解进行液相色谱分析测定，从图2和图3得知，发酵产物的峰和谷氨酸标准品的峰图保留时间一致，判定其产物为聚谷氨酸。

1. 菌株Dou-6的形态学特征挑取Dou-6菌株于筛选培养基划线培养，培养24h后观察菌落形态并照相。

另外挑取该菌菌于灭菌去离子水中，震荡后吸取菌液于载玻片上，进行革兰氏染色，用显微镜（Nikon Eclipse 80i，日本）观察并拍照。

结果：固体培养基上该菌生长旺盛，菌落黏稠，用接种环挑取能拉出细丝，菌落表面光滑且蔓延，为乳白色或半透明状。

大多数菌落粗糙有皱褶，边缘不规则（图4）。

菌株革兰氏染色呈阳性，在电镜下可以看到该菌株呈杆状分布（图5）。

2. 菌株Dou-6的生理生化特征（1）好氧性试验把灭过菌的LB培养基倒入3个已灭菌的试管中，大约在2/3处，在无菌操作台上，用接种针挑取斜面培养的所述菌，穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底）。

30 ℃培养，分别在3天至7天观察结果。

在琼脂柱表面上生长者为好氧菌，如沿穿刺线生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌。

试验结果表现，菌落沿琼脂柱表面生长，穿刺线内也有菌落生长，为兼性厌氧。

（2）过氧化氢酶的测定在干净载玻片上滴1滴3%H2O2 ，取18~24 h的LB斜面培养物1环，在H2O2中涂抹，若有气泡产生则为阳性，否则为阴性。

试验结果为接触酶阳性。

（3）甲基红试验（M.R试验）a. 培养基及试剂：蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，调节 pH7.0~7.2，分装试管，每管装 4~5 mL，121℃灭菌20 min。

试剂：甲基红0.1g，95 %酒精300 mL，蒸馏水200 mL 。

b. 菌种培养及结果观察接种菌株于上述培养液中，30℃培养 l~2 天。

在培养液中加入几滴甲基红试剂，如培养液呈现红色，为甲基红阳性，黄色为阴性（甲基红变色范围4.4红色~6.0黄色）。

试验结果为M.R阳性。

（4）乙酞甲基甲醇试验（VP试验）a. 培养基培养基同甲基红试验。

b. 菌种培养及结果观察接种与培养同甲基红试验。

做 VP 试验时，取培养液（约 2mL）和等量的40 %NaOH 相混合，加少量肌酸，充分振荡2~5 min后，如培养液出现红色，即为VP 阳性。

试验结果为VP阴性。

（5）淀粉水解试验a. 培养基及试剂在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装三角瓶，121℃灭菌20min备用。

路哥氏碘液：碘片1g，碘化钾2g，先用少量（3~5mL）蒸馏水溶解碘化钾，现加入碘片，待碘完全溶解后，加水稀释至300mL。

b. 菌种培养及结果观察取菌种点接于平板上，30℃培养2~4天，形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。

透明圈的大小一般说明水解淀粉能力的大小。

试验结果为淀粉水解阳性。

（6）明胶水解试验a. 培养基及试剂蛋白胨5g，明胶120g，蒸馏水1000mL。

调节pH7.2~7.4，分装试管，培养基高度约为4~5cm，121℃灭菌20min。

b. 菌种培养及结果观察用穿刺法接种在试管中央。

在30℃温箱中培养一个月，观察明胶是否液化。

试验结果为明胶水解阳性。

（7）硝酸盐还原试验a. 培养基及试剂蛋白胨10g，KNO31g，蒸馏水1000mL，pH7.0~7.4。

格里斯氏（Gries）试剂：A液：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸（10%左右）150mL；B液：蔡胺0.1g，蒸馏水20mL，稀醋酸（10%左右）150mL。

二苯胺试剂:二苯胺0.5g溶于l00mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。

b. 菌种培养及结果观察将试验菌接种于硝酸盐液体培养基中，30℃培养1、3、5天。

在白色瓷盘小孔中倒入少许培养液，然后在其中分别滴1滴试剂A和B液，当培养液变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等时，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性，否则为阴性。

试验结果为硝酸盐还原阳性。

（8）柠檬酸盐的利用a. 培养基及试剂柠檬酸钠2g，NaCl 5g，MgSO4·7H2O 0.2g，(NH4)2·HPO4 1g，1%澳百里香酚蓝水溶液10mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH6.8-7.0，121℃灭菌20min。

b. 菌种培养及结果观察取幼龄菌种接种于斜面上，30℃培养3-7天，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者则为阴性。