密码子的第３位。
引物５′端 可被修饰：加酶切位点、标记生物素等 引物之间 不应互补，尤应避免３′端的互补 引物自身 不应存在互补序列
三、 PCR扩增产物分析
疑胶电泳分析法 通过凝胶电泳检测扩增产物片段大小，若特异扩 增出一条带，该法即可判断结果。
注意平行对照：
• DNA分子量标准物 阳性对照 阴性对照 内参照
变性、退火及延伸的温度与时
间、循环次数
模板 primers water
PCR反应体系---模板
DNA、RNA
影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度，样品尽量纯 净，不要有核酸酶、蛋白水解酶等的污染；一般反应中的 模板数量为102 ～105 个拷贝
PCR反应时模板应充分变性
模板量过多可能增加非特异性产物。
基因 片段长 位点 度（bp）
CCATACCGACCACACCGACGA 51～71 147
GGTAGTTGGTCGTTCGCGGAC 166～198
引物设计应注意的问题
以电脑软件指导引物设计。 引物长度 15～30个碱基 G+C含量 40%～50%为宜 4种碱基随机分布 尽量避免＞4个单一碱基连续排列 引物3′端 尽量不选用T碱基 ，不能进行修饰，不终止于
• 一般用量0.5～2.5U/50ul，酶量过多易导致非特
异性产物
Taq DNA聚合酶
• 分离:1969年，美国黄石国家公园 温泉
• 分子量:94KDa • 活性：在几种水生栖热菌中活性最
高，200 000U/mg
thermostable DNA polymerases
①Taq DNA polymerase ②Tth DNA polymerase—from T.thermophilus ③VENT DNA polymerase—from T.litoralis ④Sac polymerase ⑤pfu polymerase
•基因诊断
本实验课介绍的是经典PCR技术
9700型PCR仪
PCR 循环 第一步 – 加热变性
靶序列 靶序列
PCR 循环第二步 – 引物与靶序列退火
靶序列
primer2
pprriimmeerr11
靶序列
PCR 循环第三步 - 引物延伸
primer2
Taq DNA Polymerase
• 退火时间通常30～60s。
• 延伸 延伸温度通常为70～75℃，常选72 ℃，接近于Taq DNA聚
合酶最适反应温度75℃； 延伸时间根据所选Taq DNA聚合酶和扩增 片段长度，一般在扩增反应完成后，都需要一步较长时间的延伸反 应(5～10min)，以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序 反应可能很重要
的长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度 以及引物的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。 一般当引物中GC含量高,长度长并与模板完全配对时, 应提高退火温度。 退火温度越高, 所得产物的特异性越高，有些反应甚至可将退火与延 伸两步合并，只用两种温度(例如用68℃和94℃)完成整个扩增循环, 既 省时间又提高了特异性；但温度过高易使DNA扩增效率下降。
-20℃保存，使用时稀释为10pmol/ul • 引物浓度 引物使用浓度一般在0.1～1.0μM，浓度太高会产生非特异
扩增或产生引物二聚体, 过低则降低PCR扩增产物产量
引物稀释计算方法
方法一 ：
㈠ Primer合成量为1OD ；引物长度=20bp；A/G/C/T平均分 子量=324 ，因此，总分子量=20×324=6480
• 特点 特异性强 灵敏度高 操作简便、省时 对待检材料质量要求低
㈠ PCR过程
• 由DNA模板变性、模板与引物结合（退 火）、引物延伸3个步骤组成的不断重复过 程。每次重复的3个步骤称为1个周期。
• 步骤转换通过
温度转换来控 制。
变性 94℃
• 在自动化热循
延伸
退火
环仪上实施。
74℃
50℃
㈡ PCR反应体系
防止PCR污染㈠
• 合理分隔实验室 样品的处理、配制反应液、循环扩增及产 物的鉴定. 实验前应用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA
• 预混和分装PCR试剂 所有的PCR试剂都应小量分装， -20℃保存
• 设立适当的阳性对照和阴性对照 为确保结果的可肯定性， 设置阳性及阴性或空白对照。每次反应都应有一管不加模板 的试剂对照 及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照
聚合酶链 反应技术
◎聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)
• 定义 这是一种在体外由引物(primers)介导的DNA序 列酶促合成反应，又称基因扩增技术。
耐热DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶由嗜热水生菌(Thermus aquaticus, Taq)
YT-1菌株中分离提取的。
三 聚合酶链反应
（Polymerase Chain Reaction，PCR）
一、PCR反应原理及应用
• PCR方法进行基因扩增过程类似于体内DNA的复制 过程。即在体外由引物(primers)介导的DNA序列酶促 合成反应，又称基因扩增技术。
•
特点：特异性强、灵敏度高、操作简便、省时、
对待检材料质量要求低
引物分子量
PCR反应体系--- 4种三磷酸脱氧核苷酸
(dNTPs)
• dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种等摩尔浓度混合，作 为DNA聚合酶的底物。一般PCR反应中dNTPs使用浓度 20～200 µmol/L， 4种dNTPs的浓度应该相等,以减少 PCR合成中由于某种dNTPs的不足出现的错误掺入。对 基因组DNA或较长的目标物，提高dNTPs浓度会有效
• 5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物
PCR反应体系--引物
• 引物纯度和稳定性 合成引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足 够的。通常可用去离子溶引物，注意: 实验室使用的水pH经常偏酸， 容易引起寡核苷的水解，此时，可用TE 缓冲液溶解；
• 引物贮存 公司合成的引物通常为干粉，开盖前应先离心。为使核酸 可以长期稳定保存，应用去离子水或TE溶解为100pmol/ul 贮存浓度，
果。
• 保存：购买的dNTPs应适量分装， -20℃保存，避免污
染和反复冻融。
• PCR反应体系---镁离子浓度（Mg2+)
作用 对Taq DNA聚合酶进行热激活。 Mg2+浓度 对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实 性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引 物二聚体的形成等
通常PCR引物反应需要的MgCl2终浓度为1.5 mmol/L (0.5～2 mmol/L )，如果扩增效果不好，可调整 镁离子浓度
• PCR反应体系--- 10×PCR buffer
维持反应体系pH值
PCR反应体系--- Taq DNA聚合酶
• Taq DNA聚合酶是PCR反应的重要组成部分。 Taq DNA聚合酶从5’－3’端合成DNA，具有很强 的DNA聚合能力。Taq DNA聚合酶无3’－5’端外 切酶活性，DNA扩增时没有校正功能。扩增延 伸反应后，在PCR产物3’末端附加单个碱基A， 利用此特性可将PCR产物直接进行T/A克隆。
㈡寡合苷酸 1OD 260=33ug/ml 所以：33ug/6480= 0.0050925 um =5.0925nm = 5092.5pm
㈢水稀稀释释该引50物92，.5贮pm存o浓l/1度00为pm10o0l=p5m0o.9lu/ul l（。H2O）即，用50.9ul
方法二：预稀释引物的微升数（ul）=合成OD数×33×10000
primer1
第1个 PCR 循环完成后 – 得到两个拷贝的靶序列
Polymerase Chain Reaction
PCR反应体系
• 模板
• 引物
• dNTPs
• Mg2+ • 10×PCR buffer • Taq 酶 • 循环参数：
dNTPs 10×PCR buffer
MgCl2 Taq酶
50ul PCR 反应体系为例 人基因组DNA 大肠杆菌基因组DNA λDNA 质粒DNA
0.1～1μg 10～100ng 0.5～5ng 0.1～10ng
PCR反应体系----引物设计
• 引物设计是PCR反应中最重要的一步 引物序列与模板DNA待扩增区两侧的碱基序列互补
• 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 • 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)
内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中 残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含 有不明来源的DNA。在使用扩增保守序列 的通用引物时，会在无模板对照管出现扩 增带。
保存:在-20℃至少6个月。
实验条件对PCR反应的影响
• PCR反应参数：变性温度与时间、退火温度与时间、延伸温度与时间；
•
预变性 第一轮循环前,94℃变性3～5min非常重要,使模板DNA完
• 循环次数 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于模板DNA
浓度、扩增片段的长度。一般而言25～40个循环已经足够。循环次 数过多会使PCR产物中非特异性产物大量增加，而且通常经25～40 个循环扩增后, 反应中Taq DNA聚合酶已经不足
PCR optimization 变性温度和时间 92-95℃，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或 时间过长都会导致酶活性损失。 退火温度与时间 引物中G、C含量高、 长度长并与模板完全配对时，应 提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常3755℃、1-2分钟。 延伸温度和时间 温度：72℃，接近Taq酶的最适75℃ 时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的 目的序列，则可适当增加时间。 循环次数 循环过多，非特异性产物大量增加