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y
y
图6-2-1 n
图6-2-2 n
y=A2n
y=A(1+R)n
图6-2 PCR扩增效率图
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三、PCR反应体系 ★
• 反应组成： （五要素）
– 模板（template）
• DNA
基因组DNA 质粒DNA
• RNA ： 总 RNA 、 mRNA 、 tRNA 、 rRNA 、 病 毒 RNA
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主要内容
第一节 聚合酶链反应技术的原理 第二节 聚合酶链反应技术的常见问题及体系优化 第三节 聚合酶链反应技术的方法发展及相关技术 第四节 荧光定量聚合酶链反应技术 第五节 聚合酶链反应方法的标准化
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第一节 聚合酶链反应技术的原理
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一、聚合酶链反应技术的简史
assay) • 荧光PCR
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(一)聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途
• 特点： – 分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开； – 上样量远大于琼脂糖凝胶； – 回收的DNA纯度高； – 采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝 胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色 的弱点。
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模板DNA 94℃变性 55℃退火
72℃引物延伸 第二次循环
模板变性退火
延伸
经25-30次循环，目的DNA增加106-7
图6-1 PCR原理示意图
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PCR的基本原 理
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）2
DNA引物
• •
PPCCRR反过应程条件9545℃
• PCR的特点
引物1
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PCR的基本原理
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（六）PCR一般方案 1．50 ul PCR反应体系的组成 1）组成： ①样品DNA 0.1～1ug； ②正链引物（25umol/L）1.0ul； ③负链引物（25umol/L）1.0ul； ④脱氧核苷三磷酸（dNTP各2.5mmol/L）4.0ul； ⑤10×PCR缓冲液 5.0ul； ⑥MgCl2（25mmol/L）3.0ul； ⑦Taq DNA聚合酶1～2.5u；⑧蒸馏的去离子水补
3．PCR产物的保存与检测 PCR产物于4℃保存，PCR产物检测。
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四. PCR扩增产物的检测方法
• 凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳法 、聚丙烯酰胺凝胶 电泳法
• PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP） • 单链构型多态性分析法（PCR-SSCP） • 核酸探针杂交法 • PCR产物测序 • PCR-OLA （ PCR-oligonucleotide ligation
• Watson、Crick：DNA双螺旋结构 • Meselson、Stahl:半保留复制模型 • Khorana：最早提出体外扩增核酸的设想 • Kary. B. Mullis：发明聚合酶链反应 • Saiki：发现耐热DNA聚合酶
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二. 聚合酶链反应技术的原理
PCR技术实际上是模拟体内DNA半保留复制过程, 在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依 赖于DNA聚合酶的酶促反应,由变性－退火－延伸 三个基本反应步骤构成。
聚合酶链反应技术 Polymerase Chain Reaction
李伟 温州医科大学 检验医学院生命科学学院
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聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）技术是生物技术领域中最重要的四项生物技术 （即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和 基因扩增技术）之一。由于通过体外（试管内）扩 增，可以将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放 大，从而达到极大地提高核酸分子检测的灵敏度， 理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞、甚至一 个分子的水平。
– 引物(primer)
预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异
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- DNA 聚合酶(DNA polymerase)
- dNTP: 包括dATP、dTTP、dGTP、
dCTP
- PCR buffer:
一般组成：50mM KCl, 10-50mM Tris-Cl(室 温PH8.3) ，1.5mM MgCl2
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在下一轮循环中，DNA双链再经变性、退火、 延伸三步, 模板DNA数量翻一倍(假设扩增效 率为100%)。如此反复循环，便可使DNA以指 数形式进行扩增。每完成一个循环需2-4min， 2-3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 到达平台期（plateau）所需循环次数取决 于样品中模板的拷贝数。
• PCR的特点
Taq
Taq
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PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件72℃
• PCR的特点
第2轮结束
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模板DNA
PC第1R轮的扩增基本原理 第2轮扩增
• PCR反应条件
• 第PC3R轮过程扩增
• PCR的特点
第4轮扩增第5轮扩增
第6轮扩增
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• PCR反应条57件52℃
• PCR过程 • PCR的特点
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
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PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件7924℃
• PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
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PCR的基本原理
Taq
• Taq•
PPCCRR反过应程条件957452℃
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
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PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件94℃
• PCR的特点
1 2 模板D3NA
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
至50ul。加入30ul石蜡油，短暂离心混匀。 2）对照：阳性对照、空白对照分别以阳性模板DNA、
蒸馏的去离子水取代样品DNA。
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2．PCR仪工作参数的设置 94℃ 30～60sec ， 55℃30～60sec ，
72℃30～60sec ， 循 环 30 次 ， 最 后 72℃ 延伸5min。