植物蔗糖合成的分子机制司丽珍 储成才*(中国科学院遗传与发育生物学研究所 北京 100101)摘要 高等植物中,光合同化产物主要是以蔗糖的形式从源向库运输的。

近十几年来,随着生物技术的发展,许多与碳水同化产物代谢有关的基因已经被分离,同时多种植物遗传转化体系的建立使在植物中改变基因活性成为现实,对转基因植株的生理生化分析进一步增加了植物中对碳水同化产物合成、分配、运输以及利用等方面的认识。

本文就CO 2固定,同化产物分配,蔗糖合成三个方面介绍近年来利用基因工程对植物源活性调控及改善的研究进展。

关键词 植物 碳水同化产物 蔗糖 源活性修回日期:2002 07 16*通讯作者,电子信箱:ccc hu@在高等植物中,原初同化产物一部分在叶绿体中转化为淀粉,另一部分则以三碳糖的形式输送到细胞质用于蔗糖的合成及其它代谢。

植物中同化产物主要是以蔗糖的形式从源向库输送的,因此在分子水平上研究植物碳水同化产物在源器官的分配以及蔗糖的合成对于改善源的供给能力,进一步阐明源 库关系的机理起着举足轻重的作用。

近十年来,在鉴定影响光合作用两大同化产物蔗糖和淀粉分配的关键步骤上人们已做了很多工作,蔗糖在细胞质中的合成途径已经研究清楚(图1)。

利用转基因技术,对于调控碳水化合物代谢的关键步骤进行操作,既可以反义抑制内源基因的表达,又可以过量表达一个内源基因或者外源基因,都能对碳水化合物的分配进行人为的改变。

本文重点放在对植物源活性的调控上,包括三个方面:(1)C O 2在叶绿体中的固定;(2)同化产物从叶绿体输向细胞质;(3)蔗糖在细胞质中的合成。

植物在进行光合作用时,在叶绿体内形成磷酸丙糖,磷酸丙糖一部分从叶绿体通过专一载体 磷酸丙糖 Pi 转运器与Pi 对等交换而转移到细胞质,在细胞质中经过一系列的酶促反应合成蔗糖,另一部分磷酸丙糖则在叶绿体内参与淀粉的合成。

1 同化产物在叶绿体中的合成植物的光合速率一方面取决于光强,二氧化碳浓度等因素,另一方面也受参与卡尔文循环(Calvin circle)的各种酶的活性、原初同化产物的分配、碳水同化产物的运输及在库器官的利用等自身代谢的影响。

C O 2的固定是通过卡尔文循环实现的。

它可以分为三个部分,(1)、由1,5二磷酸核酮糖羧化酶 加氧酶(ribulose 1,5 bisphosphosphate carboxylase oxygenase,简称RubisCO)催化产生3 磷酸甘油酸的羧化反应;(2)、3 磷酸甘油酸的还原反应;(3)、产生二氧化碳接受体的反应。

RubisCO 是在CO 2固定过程中,进行光合碳同化的关键性酶和限速酶,参与了光合作用和光呼吸两个过程,调节两者之间的关系,对净光合速率起着决定性的作用。

此酶的重要性又体现在它在植物可溶性蛋白中含量最高,占50%左右。

利用反义技术,在烟草中降低RubisC O 小亚基的表达,当RubisC O 含量降到野生型的60%时,光合效率仅仅下降了6%,尽管RubisCO 含量降低了40%,但处于活化态的比例升高了,所以光合效率变化并不明显;然而当下降到50~20%时,光合效率显著下降。

RubisC O 活性的降低导致卡尔第23卷第1期中 国 生 物 工 程 杂 志J OURNAL OF C HINESE BIOTEC HNOLOGY2003年1月图1 蔗糖在细胞质中的合成文循环中其它的酶活性也有所下降[1]。

虽然在光强较弱时,RubisC O的调节功能并没有表现出来,但在高光强下,RubisC O的活性是光合速率的限制因素之一,RubisCO蛋白含量的降低导致氮 碳比的升高,在叶片中大量积累氮[2]。

在转基因植株中,随着RubisCO蛋白含量的降低,类胡萝卜素、叶绿素含量也随之降低;Chl a/Chl b的比例以及质体的超微结构都没有改变,这说明RubisCO蛋白含量的降低没有影响类囊体膜的结构。

在RubisCO蛋白含量显著降低的植物中,光合效率显著降低,但光敏感性有所增加[3]。

以上结果说明此酶与光合速率很有关系,但为了更好地了解卡尔文循环对植物生长的影响,降低此循环中其它酶的活性也会很有意义。

叶绿体型1,6 二磷酸果糖酶是卡尔文循环的关键酶之一,它参与产生二氧化碳接受体的反应。

此酶在叶绿体中催化1,6 二磷酸果糖生成6 磷酸果糖,6 磷酸果糖不仅参与卡尔文循环,也参与在叶绿体中淀粉的合成。

在35S启动子的控制下,把此基因的反义序列转入烟草中。

当转基因植物中的酶活性降到野生型的10%时,植株的生长严重受阻,在高光强和二氧化碳饱和的情况下,光合速率下降了90~95%,叶绿体含量降了58%,叶片发黄。

随着转基因植物中酶含量的增加其光合速率也随之提高,当转基因植株中的酶活性增加到野生型的40%时,光合速率与对照相比仅仅下降20%,植株性状的变化就不再明显。

但在低光强的情况下,转基因植株光合速率与野生型相比,没有明显的变化。

对转基因植物中碳水化合物含量的分析表明,当酶活性降到10%时,叶片中碳水化合物的总量仅仅为对照的25%,且碳水化合物的分配也显著改变,可溶性碳水化合物与非溶性碳水化合物的比值在转基因植株中提高了2 8倍[4]。

在表达反义细胞质型醛缩酶的转基因马铃薯中,醛缩酶的mRNA和蛋白含量均有降低, Rubisco的活性有所增加,磷酸核酮糖激酶的活性略有降低,但景天庚酮糖 1,7 二磷酸酶与叶绿体型1,6 二磷酸果糖酶的活性显著下降。

随着转基因植株中酶活性的下降,光合速率也随之降低,当酶活性下降10%时,光合速率下降15%,植株性状变化不大,当酶活性降到低于野生型的60%,生长开始表现出异常,然而当酶活性下降85~90%时,生长严重受阻,根系形成缓慢,叶绿素和可溶性蛋白的含量均降低;酶活性继续降低,植株不能在温室生长,但可以长在培养基中,12中 国 生 物 工 程 杂 志第23卷这可能是因为培养基可以提供生长所需的糖分。

在转基因植物中,淀粉含量下降很多,但蔗糖含量没有明显变化[5]。

2 同化产物输出叶绿体在光合反应中,磷酸丙糖代表卡尔文循环的净光合产物,仅仅六分之一的磷酸丙糖可以从循环中出来或者参与叶绿体其它的反应,例如淀粉形成,脂肪合成等,或者被输送到细胞质中用于蔗糖、氨基酸等的合成。

叶绿体与细胞质的物质交流对于调节光合速率以满足植物组织对光合产物的需求起重要作用,这一过程是通过叶绿体的质膜系统来完成的。

在叶绿体的内膜上,有一特异的磷酸丙糖转运载体(triose phosphate translocator,TPT)来负责磷酸丙糖的运输。

菠菜中,这一29kDa的TPT占整个叶绿体内膜蛋白的15%。

磷酸丙糖从叶绿体的输出同时伴随无机磷酸(Pi)的交换,即无机磷酸从细胞质进入叶绿体。

当无机磷缺乏时,就会抑制磷酸丙糖的输出,从而使磷酸丙糖转化为淀粉贮存在叶绿体中。

磷酸丙糖转运载体蛋白是由核基因编码的,其c DNA序列已从几种植物中分离出来,序列比较证明在马铃薯、花生和菠菜中具有很高的同源性[6~8]。

TPT主要在绿色组织中表达并且其表达受光影响。

为了研究TPT的功能,其cDNA序列被反向克隆到35S启动子下,转入马铃薯中,转基因植物中TPT的mRNA与蛋白质含量均降低,当TP T 的活性降低20~30%时,植株出现矮化现象,光合作用下降。

这些数据说明TPT的活性是光合速率大小的一个限制因素。

在二氧比碳充足的情况下,虽然TP T活性的降低没有抑制光合效率,但显著地影响碳水化合物在叶绿体和细胞质的分配,磷酸丙糖由叶绿体的输出受阻,造成淀粉积累[9]。

Heineke等(1994)在转TP T反义序列的马铃薯叶绿体基质中发现磷酸丙糖含量增加,无机磷含量下降,同时伴随着细胞质中磷酸丙糖和6 磷酸葡萄糖含量的降低,因而造成蔗糖和氨基酸在细胞质中的合成受阻。

在野生型中,大约43%的同化产物被用于合成淀粉;然而在转基因植株中,61~89%的同化产物转化为淀粉。

在夜间,野生型75%的淀粉又被转化为磷酸丙糖输出叶绿体,而转基因植株把淀粉输出的比例与白天相比要高一些,这可能是为了弥补细胞质中磷酸丙糖的不足。

尽管蔗糖和氨基酸的含量没有大的变化,但蔗糖和氨基酸的合成速率均下降:这必然导致同化产物从源向库的供应降低。

同时离体实验也证明,TPT的活性降低20~30%就会改变碳水同化产物的分配,造成淀粉在叶绿体中积累,磷酸化中间产物含量下降,同时也会抑制光合速率,这表明增加TPT的活性是改变碳水同化产物分配的一条途径。

因此,增加TPT的活性,就有可能增加蔗糖的合成,从而增加源的活性[10]。

3 蔗糖在细胞质中的合成磷酸丙糖从叶绿体中运出之后,在细胞质中参与氨基酸、脂肪酸和蔗糖的合成反应。

在多数植物中蔗糖是碳水同化产物运输的主要形式。

蔗糖在细胞质中合成的主要限速酶是细胞质中1,6 二磷酸果糖酶和磷酸蔗糖合成酶,前者与6 磷酸果糖激酶和焦磷酸:1,6 二磷酸果糖转移酶共同调控1,6 二磷酸果糖向6 酸酸果糖的转化;后者催化蔗糖合成的最后一步。

因此在细胞质中增加蔗糖合成的途径之一就是通过打破这些反应的平衡,使反应向增加蔗糖合成的方向移动来实现。

3 1 焦磷酸:1,6 二磷酸果糖转移酶(pyrophosphate:fructose 6 phosphatephosphotransferase,PFP)细胞质中蔗糖合成的主要限速步骤之一是果糖1,6二磷酸(FBP)向果糖6 磷酸(F6P)之间的转化反应。

这个反应可被三个酶调控,分别是:控制顺向反应的果糖1,6 二磷酸酶(FBPase),控制逆向反应的6 磷酸果糖激酶(PFK),以及既可催化顺向反应也可催化逆向反应的焦磷酸:果糖 1,6 二磷酸磷酸转移酶(PFP)。

早在1990年,Carlisle等就已从马铃薯中克隆出编码焦磷酸:1,6 二磷酸果糖转移酶 , 亚基的cDNA序列。

通过在马铃薯中表达 , 亚基的反义序列,可使PFP的活性在块茎中降低70~ 90%;尽管转基因植物的表现型、生长速率和块茎产量都没有改变,但是在块茎中淀粉的含量比13第1期司丽珍等:植物蔗糖合成的分子机制野生型降低20~40%。

由于PFP蛋白含量的降低,导致PFP的激活剂2,6 二磷酸果糖的含量提高了2~5倍;焦磷酸的含量没有显著变化,表明PFP在调节细胞质中焦磷酸库(pyrophosphate pool)的代谢中不起关键作用。

同位素标记实验表明PFP主要推动糖酵解的反应,但没有证据证明它控制糖酵解的速度[11]。

在转PFP反义序列的烟草中,叶片基部PFP 的酶活性降低56~95%,叶片顶部则降低87~ 97%,在野生型中叶片基部是顶部的2 5倍。

其它酶的活性从叶片某部到顶部也呈现出一定的变化趋势,PFK成降低趋势,2,6 二磷酸果糖含量和叶绿体型1,6 二磷酸果糖酶活性成增加趋势,细胞质型1,6 二磷酸果糖酶的活性基本是一致的。