质粒遗传稳定性目前没有明确的规定，但一般用斜面传代法，一定数量点接抗性和非抗性板，生长计数（主要证明分裂稳定性）；更严谨时，可进一步双酶切、测序等验证（证明结构稳定性--国家药品监督管理局的新生物制品审批）。

工业用菌确实存在很多问题，免不了质粒丢失严重，高突变等现象，但是一般工业用菌都是经过10代以上稳定筛选之后才用于小试、中试和工业生产的。

菌体不稳定造可能成的损失巨大，所以鲜有工业用菌使用在2-3代菌就没有产量或者产量低的菌株。

一般来说，一代菌用一点少一点，一代菌上罐太伤了，工业用菌一般会存储足够量的二代菌（多数是冷冻干燥安瓿管）用于生产，在生产中需要活化、制作摇瓶种子，如果菌体生长慢，还要进一步做种子罐，最后才能用于生产。

如果菌体稳定性差，几代传下来，发酵的不稳定造成损失是很难估计的，而且一般不稳定菌都是先做小试、中试，成功后才能用于生产。

质粒在宿主中的稳定性确实需要进行筛选，实验中遇到的质粒突变能避免尽量避免，做好的质粒也不一定一直存放，由于不断的被用于各种改进实验，期间经过的大量筛选，避免了一代菌用完之后就没有更好的使用。

使用高保真酶扩增、保证没有物理化学因素促变，使用合适的宿主，还是很容易得到没有突变的质粒的，后续连续传代培养也可以得到比较稳定的质粒的。

质粒不稳定是重组基因工程菌培养过程中的常见问题，也是影响外源基因高效表达的限制因素之一[77~78]。

Koch[79]最早对外源基因引入宿主而对细胞产生的代谢负荷进行考察，研究表明质粒的大小、拷贝数，质粒的维持，抗性基因的表达，培养环境的变化，都会对宿主细胞产生代谢负荷，当供氧不足或营养物质受限制时，代谢负荷对细胞生长的影响会更加明显。

基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式: 一种是重组DNA 质粒的丢失, 称为脱落性不稳定; 另一种是质粒中的基因结构发生突变, 称为结构性不稳定。

这两种不稳定都能使细胞失去生产能力。

质粒的稳定性与宿主及载体的特性有关, 也与培养条件有密切的关系。

试验一：遗传稳定性验证（斜面活化代时）
连续传代实验：将构建好的四个质粒pBES、pBEF、pBESF和pBEG分别转化进入B. amyloliquefaciens TA208，取工程菌的培养液梯度稀释到合适浓度，涂布于LB（+）（含10 μg/mL 卡那霉素）平板，37 ℃培养16 h后随机挑取50个单菌落，同一菌落分别接种于LB（+）和LB（–）（不含卡那霉素）上，于37 ℃培养16 h（第1代）。

将LB（+）上的菌落接种于LB（+）平板上，LB（–）上的菌落接种于LB（–）平板上，于37 ℃培养16 h（称为第2代）。

依此进行连续转接50次，分别计算两个平板上菌落生长数。

平板传代稳定性实验：在传代过程中，每隔5- 10代将LB（–）平板上的菌落接种于LB（+）平板上，菌落计数，计算该基因工程菌在无选择压力下的遗传稳定性。

将各基因工程菌株分别在LB（+）和LB（-）上连续传代培养，在传代过程中LB（+）上的菌株长势都非常好，说明在抗生素压力下，菌株稳定性良好，未发生质粒丢失情况。

但在无抗生素压力下，如图3-11所示LB（-）上生长的50 个单菌在连续传代过程中，传代30次左右质粒开始丢失，到第50代18 % 的菌落质粒已经丢失，并且各工程菌株的质粒稳定性没有显著性差异。

说明工程菌株遗传稳定性一般，需要在传代及培养过程中加入抗生素，这对工业化生产和菌种保
藏均有重要意义。

图3-11 重组菌株的遗传稳定性测定
Fig. 3-11 The test of heredity stability of recombinant strains
试验二：质粒稳定性研究（分裂代时）
段取样涂布，挑单*50，分别接抗性与非抗性板，计算；同时转接至下一时间段。

）结果如图3‐25所示：
图3-25 质粒稳定性研究
Fig. 3-25 The plasmid stability test
摇瓶发酵培养30 h，约有10%的菌株丢失质粒；培养至50 h，质粒丢失率约为15%，且质粒pXMJ19和pXMJ19‐ilvA( F383V)的稳定性差异不大，说明ilv A (F383V)基因的插入不会影响质粒pXMJ19的稳定性。

同时在发酵生长期？？质粒的丢失率高于中后期，推测分裂不稳定是此质粒丢失的主要原因。