---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 实验8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定
实验 8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定Ⅰ．斐林-酚试剂法 [原理] 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。
在 650nm 时比色测定的灵敏度比双缩脲法高 100 倍。
由于肤键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。
该法适于微量蛋白的测定(范围为 5～l00μg 蛋白质)。
[材料、仪器设备及试剂] (一)材料各种植物材料。
(二)仪器设备 722 分光光度计，离心机，恒温水浴，定量加样器，冷凝回流装置一套，研钵，离心管，刻度移液管，微量滴定管，试管等。
(三)试剂 (1)0．5mol／L Na0H。
(2)斐林-酚试剂甲液：由 A、B 两种溶液组成： A 液：4％碳酸钠(Na2C03)溶液与 0.2mol/L 氢氧化钠(Na0H)溶液等体积混合。
B 液：1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液与 2％酒石酸钾钠溶液等体积混合。
使用前将 A 与 B 按 50:1 的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制。
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(3)斐林-酚试剂乙液：称取钨酸钠(Na2W04。
H20)100g，钼酸钠(Na2Mo04·2H20)25g，加蒸馏水 700ml 溶解于 1500mL 的圆底烧瓶中。
之后加入 85％的 H3PO450mL，浓 Hcl 100 mL，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾 10h。
冷却后加入硫酸锂（Li2SO4.H2O）150g,蒸馏水 50ml，溴水 2-3 滴，打开瓶口煮沸 15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸 15min）。
待冷却后稀释至 1000ml，过滤入棕色瓶中保存。
使用时大约加水 1 倍，使最终浓度相当于 1mol/L 酸度。
因此在使用前应进行标定。
标定方法：取 5ml 福林-酚试剂乙液放入锥形瓶内，用 1mol/L 标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞作指示剂，当溶液突然转红再转灰绿时，即为滴定终点。
计算其相当的酸度，用盐酸或氢氧化钠溶液调至相当于 1mol/L 的酸度。
在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性稳定，但此实验的瓜只在pH≠10 的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。
⑷标准蛋白质溶液：称取 25mg 牛血清蛋白，溶于 100ml 蒸馏水
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 中，使终浓度为250μg/ml。
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[实验步骤] （一）标准曲线的绘制（1）取18mm×200mm 试管 7 支，编号， 1-7 分别加入 0mL、 0.1mL、 0.2mL、 0.4mL、 0.6mL、0.8mL、1.0mL 标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足 1mL，使每管含蛋白量分别为0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L。
（2）用定量加样器给每支试管中加入 5mL 甲液，混匀，于30℃下放置 10min。
（3）再向试管中喷射加入 0.5mL 乙液，立即振荡混匀，30℃下准确保温 30min 在（4）以不加标准蛋白的 1 号管为空白，在650nm 下用 1cm 光径的比色皿测定吸光度。
以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
(二)样品的测定样品的提取：称取鲜样 0．5g，用 5mL 蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，10000 r／min 离心 10min，取上清液1．0mL（视蛋白质含量适当稀释) 于试管中，然后重复标准曲线绘制中的 2～4 步骤，以空白管调零，测定吸光度。
根据吸光度查标准曲线，求出样品中的蛋白质含量。
[结果计算] 样品中蛋白的含量＝ (mg／g) 式中：C 为查标准曲线值，μg；VT 为提取液总体积，mL；WF 为样品鲜重，g；Vs 为测定时加样量，mL。
' 注意事项还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。
Ⅱ．考马斯亮蓝G-250 染色法[原理] 考马斯亮蓝
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G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在 465nm，后者在 59511nm。
在一定蛋白质浓度范围内(1～1000μg)，蛋白质与色素结合物在595nm 波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合反应十分迅速，2min 左右即达到平衡。
其结合物在室温下 1h 内保持稳定。
此法灵敏度高(比斐林-酚法还高 4 倍)，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。
其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
[材料、仪器设备及试剂] (一)材料小麦叶片及其他植物材料。
(二)仪器设备 722 分光光度计，研钵，烧杯，量瓶，移液管，具塞刻度试管等。
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(三)试剂 (1)标准蛋白质溶液：100μg／mL 牛血清白蛋白：称取牛血清蛋白25μg，加水溶解并定容至 100mL，吸取上述溶液 40mL，用蒸馏水稀释至 100mL 即可。
(2)考马斯亮蓝 G-250 溶液：称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250，溶于 50mL 90％乙醇中，加入 100mL 85％(W／V)的磷酸，再用蒸馏水定容到 1L，贮于棕色瓶中。
常温下可保存一个月。
[实验步骤] (一)标准曲线的绘制取 6 文具塞试管，按表2-29-1 加入试剂(0～100μg／mL 的标准蛋白)。
混合均匀后，向各管中加入 5mL 考马斯亮蓝 G-250 溶液，摇匀，并放置 5min 左右，用 1cm 光径比色皿在 595nm 下比色测定吸光度。
以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
(二)样品测定 (1)样品提取。
方法与斐林-酚试剂法相同。
(2)吸取样品提取液 1．0mI，放人具塞试管中(每个样品重复 2 次)，加入 5mL 考马斯亮蓝 G-250 溶液，充分混合，放置 2min 后在 595nm 下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。
[结果计算] 样品中蛋白质的含量＝ (mg／g) 式中：C、VT、WF、Vs 的表示意义与斐林-酚法相同。
Ⅲ．紫外吸收法 [原理] 蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸等残基在 280nm 波长下具有最大光吸收。
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 由于各种蛋白质中都含有酪氨酸，因此 280nm 的光吸收度是蛋白质的一种普遍性质。
在一定程度下，蛋白质溶液在 280nm 吸光度与其浓度成正比，故可作定量测定。
核酸在紫外区(260nm)也有吸收，可通过校正加以消除。
[材料、仪器设备及试剂] (一)材料．小麦叶片及其他植物材料。
(二)仪器设备紫外分光光度计，离心机，刻度移液管。
(三)试剂 0． 1mol/L PH 7．0 磷酸缓冲液。
[实验步骤] （一）样品提取与菲林-酚法相同。
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（二）测定取适量的样品提取液，根据蛋白质浓度，用 0.1mol/L pH7.0 磷酸缓冲液适当稀释后，用紫外分光光度计分别在 280nm 和260nm 波长下读取吸光度，以 pH7.0 磷酸缓冲液为空白调零。
[结果计算] 蛋白质浓度=1.45A280-0.744A260 mg/mL）蛋白质含量= 式中：（ 1.45 和 0.74 为校正值：A280 为蛋白质溶液在 280nm 处的吸光度；A260 为蛋白质溶液在 260nm 处的吸光度；n 为稀释倍数。
思考题 1．测定植物体内可溶性蛋白质含量有什么意义和用途?试举二例说明。
2．三种测定方法各有何优缺点?在实验中如何选择合适的方法并克服其缺点? 3．福林-酚试剂法测定蛋白质含量的原理是什么?测定中应注意什么问题?。