拟南芥psrp．3基因的PCR 扩增与生物信息学分析

拟南芥psrp．3基因的PCR扩增与生物信息学分析 [摘要] 采用PCR法获得拟南芥叶绿体核糖体psrp．3基因序列并进行生物信息学分析．根 据psrp．3基因序列保守区设计2对引物，通过RT-PCR获得预期大小的基因序列，琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段．利用生物信息学软件对拟南芥psrp．3基因序列进行同源比对、氨基酸组成、功能域、二级结构、疏水性、蛋白质功能及系统进化分析和预测．结果表明，RT-PCR获得了一段753 bp的序列，psrp一3蛋白是等电点为9．27的亲水性稳定蛋白，包含一个结构域和一个区域，a螺旋和不规则卷曲是其蛋白质二级结构的主要结构元件，p折叠和伸展链散布其中，和菠菜、葡萄、蓖麻、大豆等的psrp．3蛋白有较高的同源性．为进一步了解psrp．3基因的功能和作用机制打下基础． [关键词] 拟南芥；叶绿体；psrp一3基因 引言 叶绿体是植物细胞和真核藻类的重要细胞器，是植物进行光合作用的场所．叶绿体是半自主性细胞器，具有自身独立的遗传体系和蛋白质合成的全套机构，包括核糖体．叶绿体基因组是植物基因工程研究的热点u剖．至2006年底，已经公布了包括不同物种的叶绿体基因组数据82组，这其中包括同一个种的不同亚种∽J．研究发现，叶绿体70S核糖体含有58。62个核蛋白，其中约有2／3由核基因组编码，其余1／3由叶绿体基因组编码…1．虽然组成叶绿体的绝大多数蛋白质都是来自细胞质，但目前在各种植物的叶绿体中已确定了20个电子传递和光合固碳的基因：编码RuBP羧化酶的大亚基，Ps I的2个亚基，PsⅡ的8个亚基，ATP合成酶的6个亚基，细胞色素b／f复合物的3个亚基，这些都是叶绿体核糖体所合成的重要蛋白质∞剖．因而，研究叶绿体核糖体的重要基因，不仅可以在分子水平上阐明蛋白质之间的相互作用、光合作用各过程的调控，而且可以了解叶绿体的起源与进化、核质互作关系．在叶绿体核糖体中存在着6个特殊的蛋白质(质体特异性核糖体蛋白，plastid．specific ribosomalpro．teins，psrps)，它们都是由核基因编码．其中，psrp—l，psrp-2，psrp．3，psrp-4位于30S小亚基上，psrp-5，psrp-6位于50S大亚基上b4J．叶绿体核糖体只负责合成叶绿体DNA编码的不到一百个多肽，但是其中却包括一些在生物圈中含量最丰富的蛋白质．因而，叶绿体核糖体必须能够维持一个比较高的蛋白质合成率，并且必须具备响应光强度的变化而改变蛋白质合成速率的机制．为了满足光合成蛋白质的需要和核糖体功能的协调，在长期的进化过程中，叶绿体转录翻译发展了大量叶绿体特异的调控元件．定位于核糖体的psrps，就是这样的一套调控元件．psrps可能以总体的形式参与叶绿体中蛋白质合成调控，但目前作用机制并不清楚． Psrp-3基因在拟南芥存在两个同源基因，分别位于染色体I和染色体V(ATlG68590，AT5G15760)上．ATlG68590可以表达，AT5G15760不转录，有可能是伪基因或沉默基因，只在特殊条件下才会表达怕J．psrp．3基因所编码的psrp．3蛋白存在两种形式，一种是N．末端经过翻译后修饰，一种未修饰．这两种形式之间的比率是否固定目前尚不清楚，很可能依据光照强度和光照时间的改变而变化【3,6]．psrp．3蛋白质参与光介导的叶绿体蛋白合成，但其在光介导蛋白合成中的具体功能及作用机制，迄今尚无研究报道． 1材料与方法 1．1材料 1．1．1植物材料 拟南芥(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)Columbia生态型(col一0)．培养条件：光照强度I>3 000 Ix，光暗周期为12 h／12 h，温度为(25±1)℃，相对湿度约70％．生物信息学分析以NCBI数据库中的拟南芥psrp-3基因(ATl G68590)作为研究对象． 1．1．2茵株和质粒 大肠杆菌JMl09、质粒pBIl21载体由南京中医药大学第--I临i床学院针药结合实验室保存． 1．1．3试剂及工具酶TaqDNA聚合酶、反转录酶、dNTP、OligadT等购自宝生物工程(大连)有限公司和上海生工生物公司，DNA分子Marker、DNA回收试剂盒、琼脂糖等其他相关生化试剂购于上海生工生物公司．引物由大连宝生物公司合成． 1．2方法 1．2．1拟南芥总RNA提取 用Tfizol试剂法提取叶片总RNA：将0．3 g叶片放在180℃热处理过的研钵中，加入液氮，迅速研磨成粉末，然后将粉末放入装有l mLTrizol试剂的Eppendorf管中．用宝生物公司提供的RNAiso Reagent试剂盒提取总RNA，经琼脂糖电泳检测总RNA质量． 1．2．2引物设计与psrp-3基因的RT．PcR扩增反应 根据GenBank已登录的拟南芥psrp．3基因序列(ATlG68590)，设计合成引物【10]．并根据植物双元载体pBIl21的多克隆酶切位点，分别设计2条含有Sac I和XbaI限制性内切酶位点的PCR引物．上游引物R：5’．CGTCCA7唧AGACAcAAAA7rCTCCA田GT形硼盼3’，下游引物L：5 7．A’rCGAGAGCTCAA CI’cAGAGTrGCI'IGATG'IqqB3’．以拟南芥RNA为模板，R和L为引物，进行RT-PCR扩增．在PCR管中加入总RNA 8皿，Oligo dT 2皿置于70℃5 min，然后放于冰上；再依次加入5 x Buffer 4 gL，10 mmol／L dNTP 2ttL，AMV l汕，RNase Inhibitor 1肚，42℃放置60 min，冰上冷却，产物置于70℃保存．50μL PCR反应体系为：Ex-Taq25μL，cDNA2μL，引物R和L各1μL，去离子水补至50μL．反应条件为：预变性94℃，2 rain；循环参数，94℃，30 s；52℃，30 s；72℃，1 min 30 s；循环数35；最后延伸，72℃，5 min；4℃保存．PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下割取含有目的片段的凝胶，由试剂盒回收PCR产物，将回收的片段与pBll21载体连接，转化大肠杆菌JMl09，通过菌落PCR方法筛选重组子，提取阳性克隆的质粒DNA，由大连宝生物公司完成测序． 1．2．3蛋白序列同源性分析和系统进化树构建 利用NCBI数据库中的Blot软件将目的基因编码的氨基酸序列与GenBank中的氨基酸序列进行比对和相似性搜索，获得玉米、葡萄、大麦、蓖麻、水稻、拟南芥和大豆等物种的序列数据和信息．进而利用ClustXl．83软件进行多序列同源性比对和聚类分析【13-14]．聚类分析包含以下20个物种的序列：蓖麻(Ricinus communi8(castor bean)，XP-0025291 30)、毛果杨(Populus trichocarpa，XP-IX)23 15948)、葡萄(Vitisvinifem，CAN68341)、菠菜(Spinacia oleracea，P82412)、大豆(Glycine lI瞰，ACUl4369)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，ACJ86010)、北美云杉(Picea sitchensis，ABK26571)、玉米(zea mays，NP-001148519)、水稻(Ormsativa，NP-001052994)、高梁(Sorghum bicolor，XP-002446621)、醉蝶花(Cleome spinosa，ABD96848)、小立碗藓(Physcomitrella patens subsp．patens，XP．001778658)、大麦(Hordeum vulgare，048609)、绿球藻(Chlorokybus atmophytieus，m001019068)、紫红紫菜(Porphyra purpurea，NP-053961)、条斑紫菜(Porphyra yezoensis，YP-537032)、蓝细菌(Synechococcus sp．CC9902，m376514)、囊泡藻(Vauchefia litorea，ⅥL002327484)和赤潮异弯藻(Heterosigtm akashiwo，YP-001936340)．进化树使用MEGA4软件的邻接归并法(NJ法)构建，Kimum两 参数模型(Kimura 2-parameter)，自展检验(bootstrap analysis)重复l 000次． 2结果 2．1拟南芥psrp．3基因的PCR扩增及鉴定 提取的总RNA纯度高(见图1)，通过琼脂糖凝胶电泳观察，结果表明RNA有略微降解，28sRNA的亮度与18sRNA亮度相若．以提取的总RNA反转录的cDNA为摸板，用psrp．3基因的特异引物对cDNA进行PCR扩增，扩增产物经l％琼脂糖凝胶电泳鉴定(见图2)，得到的扩增条带为约750 bp的单一条带，与目的片段大小相同．所得产物回收后，将该片段连接到pBll21载体上，转化大肠杆菌JMl09，得到重组质粒，委托大连宝生物公司实验室测序，所得结果用BLAST软件在生物信息学数据库中进行搜索，发现和NCBI数据库中的拟 南芥psrp一3基因(ATlG68590)序列完全一致，说明所扩增的条带为psrp．3基因cDNA克隆． 2．2 psrp-3蛋白的基本理化性质分析 对基因序列及其氨基酸羊列进行分析发现，psrp．3基因cDNA全长753 bo，有1个开放阅读框(核苷酸59～556)，编码l条166个氨基酸残基的蛋白质，由l条44个氨基酸的转运肽和121个氨基酸的成熟蛋白组成．对所推测氨基酸序列进行分析表明，该蛋白相对分子质量为18 472．4，等电点为9．27，负电荷残基(Asp+Gh)总数为13，正电荷残基(Arg+Lys)总数为17，分子式为C,832H1333N2170‰&，原子总数为2 632，不稳定系数为38．35，该蛋白分类为稳定蛋白．脂肪系数为89．28，亲水性评估为一0．212，依据氨基酸分值越低亲水性越强和分值越高疏水性越强的规律，可见该蛋白为亲水性蛋白．该蛋白中相对含量比较多的氨基酸为Ser(18个，占10．8％)，含量比较少的氨基酸是Tyr(1个，占0．6％)．相较于藻类和光合细菌psrp．3，拟南芥成熟psrp．3有1个延长的N．末端和1个截断的c．末端． 2．3系统发育分析 我们将玉米、大麦、水稻、拟南芥、葡萄、苜蓿、菠菜、蓖麻、毛果杨、云杉和大豆等20个物种的psrp．3序列集合到一起，进行多重序列比对，根据psrp一3序列揭示的遗传分化 距离，采用邻接法构建并绘制了系统进化树．分析表明，供试物种的psrp．3序列具有非常高的同源性，这种高同源度在保守的功能结构区域——YcF65更为明显．从构建的进化树可以看出，供试的20个物种的psrp．3被聚成两个大类．囊泡藻和赤潮异湾藻的psrp。3聚为