•Southern blot步骤
•（1）待测核酸样品的制备：提取基因组DNA，并用 适当的限制性内切酶消化水解基因组DNA，成大小不 一的DNA片段。 •（2）待测DNA样品的电泳分离。 •（3）凝胶中核酸的变性：DNA在制备与电泳过程中 DNA片段始终保持双链结构。电泳结束后DNA变性并 转移到适当的固定支持物上才能进行Southern blot。 •变性通常用碱变性法。
将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行 Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析， 以便最终获得差异表达的目的基因。
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尽管应用 差异显示PCR方法已经取得了不少成果 ，而且该方法还在不断改进之中，但它仍然存在几个 难以解决的问题：但它仍然存在几个难以解决的问题 ：(1)重复率低，至少有20%的差异条带不能被准确重 复；(2)假阳性率可以高达90%；(3)获得的差异表达序 列极少包含编码信息。
•G
•5`* GATCACTACTG •5`*G
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•G+A •甲酸 •C+T •肼
•5`*GATCACTACTG
•5`*GATCACTACT •5`*GATCACTAC
•5`*GATCACTA •5`*GATCA •5`*GA •5`*G
•5`*GATCACT •5`*GATCAC •5`*GATC •5`*GAT
•G+A
甲酸
脱嘌呤作用 六氢吡啶 G/A
•C+T
肼
嘧啶开环 六氢吡啶 C/T
•C
肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶 C
•在化学修饰反应中，通过控制反应温度和反应时间，只有 一小部分碱基被修饰，随后进行断裂反应也是定量。
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•5`-GATCACTACTG-3`
•硫酸二甲酯
•5`*•-GATCACTACTG-3`
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（6） Southern杂交：在将固定于膜上的DNA片段与探 针进行杂交前，必须先进行一个预杂交的过程。因为 能够结合DNA的膜同样可以和探针DNA结合，在进行 杂交实验前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全 部封闭。
（7）杂交结果的检测：采用核素标记的探针或发光剂标 记的探针进行杂交时，在杂交洗膜后，将滤膜和X线片 装入暗盒，感光后，经冲洗，在X线片上可见黑色条带 。
•
2、化学裂解法
•
3、PCR测序技术
•
4、全自动DNA测序仪
•这些技术的发明,都依赖于高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术
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•双脱氧测序方法原理
Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸（ 2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。2ˊ,3ˊ-ddNTP脱氧核 糖的3ˊ位缺少羟基，它可以与多核苷酸链的3ˊ羟基形 成磷酸二酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致多 核苷酸链的延伸终止。 如果在DNA的合成反应中，加入一种少量的ddNTP，则多 核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列长短 不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中，分别加 入4种不同的ddNTP，结果生成的4组核苷酸链将分别终止 于各个A，G，C，T的位置上。对这4组核苷酸链进行高分 辨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。
原位杂交不需要从组织提取核酸，对组织中含量 极低的靶序列有很高的灵敏度，并可完整保持组织与 细胞形态，更能准确反映出组织细胞的相互关系及功 能状态。
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根据检测对象不同可将原位杂交分为细胞内原位 杂交和组织切片原位杂交。同时原位杂交既可检测 DNA，也可检测RNA，所用探针不同而以。
4、通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺 凝胶电泳，将DNA断裂片段按分子大小分离开
5、根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段分布情况 ，直接读出DNA序列。
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•反应体系 碱基修饰
•
试剂
•
•G
硫酸二甲酯
碱基修饰 反应
鸟嘌呤甲基化
主链断裂 试剂
六氢吡啶
断裂点 G
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•化学裂解法（Maxam-Gilbert）
•
1977
基本步骤：
1、先将DNA的末端之一标记放射性同位素（32P、35S），
2、再将DNA样品分别进行多组具碱基特异性、随机的、 不完全的化学修饰；
3、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断 开DNA链；
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实时PCR原理是：在PCR反应体系中加入一种双色 荧光标记的寡核苷酸探针，并根据探针上荧光信号的 变化计算模板DNA含量。如：TaqMan系统
在寡核苷酸探针的5`端标记一个报告荧光染料， 3`端标记一个猝灭染料。当光源照射到探针时，被激 活的报告荧光染料将能量转移给附近的猝灭染料而不 发光。当PCR产物扩增时，聚合酶遇到结合在模板上的 荧光探针时，利用聚合酶所具有的5`-3`外切酶作用， 将两种染料分离，因此根据报告荧光所发射的荧光强 度与被切探针成正比，由此可以计算出PCR产物的含量 。
•5`* GATCACTACTG
•5`*GATCACTACT
•5`*GATCACTAC •5`*GATCACTA
•5`*GATCACT
•5`*GATCAC •5`*GATCA
•5`*GATC •5`*GAT
•5`*GA •5`*G
•C•肼（加盐）
•5`*GATCACTAC •5`*GATCAC •5`*GATC
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•（3）实时PCR用于基因拷贝数分析
实时PCR根据PCR反应动力学特点设计的分析方法 。在PCR反应的初始阶段，反应体系中的模板的产物深 度较低，而引物是过量的，产物和模板复性不会形成 与引物竞争，此时产物含量呈指数增加。当PCR产物积 累后，产物的复性可以竞争引物与模板的结合，产物 增加减慢，最后进入平台期。所以对样品中的cDNA进 行定量分析的最佳时期是反应早期。有人试图依靠循 环次数减少来分析样品中的cDNA含量，但因样品的差 异使之很不可靠。在一定的循环中，mRNA丰度低的样 品产量少，可能尚不能检测，丰度高的样品可能已进 入平台期，故难以较。
实时PCR技术 5、研究基因表达产物的水平：Western Blot、
流式细胞仪（ FACS ）
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•第一节 利用DNA定性、定量分析可从不同角
度
•
对基因和基因组进行研究
•一、DNA序列测定可以揭示基因和基因组一级结构变化
•DNA测序技术：
•
1、双脱氧链终止法(Sanger法)
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•（2）、代表性差异分析技术
•该技术是将差减杂交与PCR有机结合形成的一种方法.主要步 骤: •1、将对照组(driver)和待测组(tester)mRNA逆转录成cDNA 片段群,接上接头进行第一次PCR扩增; •2、将两组PCR产物片段群用限制性内切酶酶切,形成平均长 度256bp的长度. •3、将接头消化,在tester组末端接上新的接头,tester组和 driver组按1:100比例混合.过量的driver可与tester中互补 的部分形成双链. •4\复性,按新接头序列设计引物进行第2轮PCR，只有tester 和tester杂合体才能和引物配对,大量拉增.
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•Southern blot 检测基因拷贝数注意事项
1、对某种生物体基因组拷贝数研究，需要 完整提取出基因组，并需要适当的限制 性内切酶酶切；
2、通常要研究的基因序列是已知的。
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•二、采用PCR技术也可以分析基因拷贝数
•原理： •细胞内DNA复制是一个复杂过程。参与复制的有多种因 素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，PCR原理与细 胞内DNA复制相似，但反应体系相对简单。 •PCR反应体系： •耐热的Taq DNA聚合酶、化学合成的寡聚核苷酸引物、4 种dNTP、以及合适的缓冲液体系。 •PCR反应的基本过程：变性、退火、延伸
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•（1）差异显示PCR用于基因拷贝数分析
是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA） 结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转 录成cDNA。
根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设 计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物；同时为扩增出polyA上游 500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随 机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA 条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定 发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。
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实时PCR技术特别适合于低拷贝基因的定 量。
实时PCR需要包括热循环仪、计算机、光 学仪器用于荧光激发和收集器、数据处 理和分析软件。
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•三、原位杂交技术可以分析基因在染色体上位置
核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细 胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核 酸进行杂交，称为原位杂交。
•DNA自动测序仪
•上述两种方法都不适应大规模DNA测定需要。存在操作 步骤繁琐、效率低、速度慢的缺点，特别是读结果的读 片过程。 •1987年发明了一种准确快速的DNA测序方法，即激光 测序法和配套的自动测序仪。（用荧光染料结合引物） 。随后又发明了终止标记系统法。