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7.3.1 遗传病的基因治疗
1、重症联合免疫缺陷（SCID）：体液免疫和 细胞免疫联合缺陷 ADA基因隐性突变 2、血友病B：IX因子 3、囊性纤维化（cysticfibrosis,CF ）
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4、心血管病的基因治疗
• 心脑血管病包括：单基因遗传病、多基因遗传病
单基因遗传病：家族性高胆固醇血症、遗传性心 肌营养不良、遗传性心肌扩张等。
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逆转录病毒载体优点： 1、基因组小而简单，可随机整合 2、感染效率高 3、侵染范围广 4、原病毒稳定拷贝数低 5、对宿主细胞无毒副作用 6、10 kbDNA 缺点： 1、仅转染分裂期细胞；2、随机插入的风险
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基因治疗基本过程 例1
ADA-Gene + vector （逆转录病毒） 重组分子 患者T Ly C 导入 细胞生长分裂 10天 Gene表达 IL-2刺激C分裂
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逆转录病毒载体特点： 1、可整合到染色体中 2、表达时间长 3、可感染分裂细胞
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• 外来基因风险多大 • 由于目前进行基因替换时，正常基因在染色体上 的整合并不能保证绝对精确，因此在安全性上有一定 的风险。法国几年前发生的SCID-X1（严重复合免疫 缺陷）患者接受基因治疗后反而患上白血病的事件， 就是因为逆转录病毒载体插入到造血系统原癌基因 LMO2启动子附近从而将LMO2激活造成的。 • 此外，由于人类对自身生理活动了解的局限性， 使得人们无法预知基因治疗的长期生理效果。虽然针 对生殖细胞的基因治疗仍是科学研究的禁区，但体细 胞基因治疗的目的基因是否会传给下一代？美国加州 的Avigen公司将正常基因导入B型血友病患者的肝脏， 在治疗过程中却发现患者的精子中带有目的基因的病 毒载体。
• PCR扩增因子VIII基因 的18号外显子142 bp片段
142 bp 99 bp 父 母 儿 胎儿
• Bcl I 限制酶：酶切位点在 基因内18号外显子3´端 • 电泳染色,分析片段的 家系分布,作出产前诊断
( 先证者) (女)
感染性疾病的基因诊断
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基因治疗
基因治疗（gene therapy） ：指以正常的基 因替代或修补病人细胞中的缺陷基因从而达到 治疗疾病的目的，它是治疗分子疾病最有效的 手段之一。（狭义） 广义：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使 其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。
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腺病毒载体优点： 1、易于制备、培养、纯化和浓缩 2、转化效率高 3、晚期启动子强，表达水平高 4、可感染分裂与非分裂细胞 5、不整合到基因组中 6、可在呼吸道和肠道中繁殖 缺点： 1、短暂表达；2、免疫原性强；3、载体基因组 复杂，装载容量小；4、缺乏组织特异性
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7.2.4 单纯疱疹病毒
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多基因遗传病：高血压、动脉粥样硬化、心肌肥 厚、梗塞性血管病、心功能不全等。
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7.3.2 肿瘤的基因治疗
• • • • • 1 2 3 4 5 抑癌基因治疗 针对癌基因的基因治疗 肿瘤的免疫基因治疗 针对耐药基因治疗 自杀基因治疗肿瘤
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1 抑癌基因治疗
• 肿瘤的发生和发展是一个多因素、多步骤、多 基因参与的复杂过程。 • 主要是因为抑癌基因的失活与癌基因的激活。
是通过封闭癌基因、抑制癌基因的过度表达而 实现的。利用反义癌基因与肿瘤细胞内癌基因 mRNA等结合，减少癌基因的表达或调整癌基 因表达的比例。
RNA干扰（RNAi）：siRNA 核酶（Ribozyme）技术：
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3 肿瘤的免疫基因治疗
肿瘤发生后免疫功能下降的原因： 肿瘤细胞免疫性不强 抗原递呈细胞不能提供足够的共刺激信号 机体免疫因子分泌不足
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基因治疗－－社会伦理学上的挑战
治疗的安全性问题 基因治疗模式与现有伦理道德的冲突。
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7.2 基因治疗的载体
7.2.1 逆转录病毒载体 7.2.2 腺病毒载体 7.2.4 单纯疱疹病毒
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7.2.1 逆转录病毒载体
• 正链RNA病毒 • 5’ gagpolenv 3’ (编码核心蛋白)(逆转录酶)(编码病毒包膜蛋白) • 病毒感染细胞后，逆转录成双链DNA，整合在染 色体上，以此合成病毒基因及RNA，装配成病毒 颗粒。
单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV）: 嗜神经性病毒 潜伏、激活
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7.3 重要疾病的基因治疗
7.3.1 遗传病的基因治疗 7.3.2 肿瘤的基因治疗 7.3.3 艾滋病的基因治疗
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• 用于基因治疗的基因包括三大类： ①正常基因：置换、弥补；遗传性分子疾病 ②反义基因（基因干预）：获得性分子疾病 ③自杀基因：是编码能杀伤癌变细胞的酶蛋白 基因。
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7.1.3 基因治疗的现状与问题
• 恶性肿瘤 64.6%，心血管8.9%，艾滋病7.9% • 美国63.4%，欧洲27%，日本与澳大利亚1.1% 和1.8%
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基因治疗－－理论和技术上的挑战
1.缺乏更多更好的治疗基因： 2.缺乏高效特异的基因导入系统：转移效率、特 异性 靶向载体 3.治疗基因表达缺乏可调控性：包括空间上的可 调控性和时间上的可调控性。 4.表达水平低 5.随机整合带来的问题
• ③这种以外源基因修饰的肿瘤细胞称为瘤苗，目 前采用的外源基因多数是细胞因子基因。
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基因修饰瘤苗基因治疗过程
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4 针对耐药基因治疗
• 多药耐受（multiple drug resistance， MDR）：指肿瘤细胞接触某一抗癌药物产生 耐药的同时，也对其它结构和功能不同的药物 产生交叉耐药性。 • MDR1，P-gp：跨膜整合糖蛋白
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பைடு நூலகம்
7.2.2 腺病毒载体
• 腺病毒（Adenovirus，Adv）：一类20面体 病毒 • 含一个线形双链DNA分子（Ad-DNA）， 35kb左右，从成熟的病毒颗粒中分离的DNA 具有传染性。 • 两端具有反相重复序列（IRT），5’端共价结 合一种蛋白（TP）分子。 Ad-DNA从病毒颗 粒中释放的时候，依靠TP自行环化。
自杀基因的作用机制
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7.1.2 基因治疗基本程序
①基因诊断：利用多种基因检测技术如限制性 片段长度多态性分析（RFLP）、PCR扩增靶序 列法和人类基因库搜寻法等对人体病变基因进 行定位。 ②基因分离：指利用DNA重组技术克隆、鉴定、 扩增和纯化用于治疗的基因，并根据病变基因 的定位，与特异性整合序列和基因表达调控元 件进行体外重组。
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③载体构建： • 病毒型载体：腺病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、 反转录病毒载体等，它是基因治疗中使用的主要 载体； • 非病毒型载体：脂质体载体和多聚阳离子载体等。
④基因转移： • 体内疗法：病毒颗粒直接注射法、重组DNA分子 直接注射法、呼吸道吸入法、基因枪转移法和电 穿孔法等。 • 体外疗法：病毒转染法。
基因治疗途径： • 体外基因治疗（ex vivo）：是将含外源基因的表达 载体导入人体自身或异体细胞，经体外细胞扩增后 输入人体。 • 体内基因治疗（in vivo）：是将含外源基因的真核 细胞表达载体直接导入人体内。 已从单基因疾病扩大到多基因疾病，从遗传性疾病 扩大到获得性疾病。
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基因治疗的两种途径
• 中国：1991年7月开始进行基因治疗临床实验， 血友病B，Ⅸ因子治疗后浓度上升，出血症状 减轻,取得了安全有效的治疗效果。
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基因治疗： • 生殖细胞(germ cell)基因治疗 • 体细胞(somatic cell)基因治疗：骨髓细胞、 皮肤成纤维细胞、肝细胞等，随机整合
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7.1.1 基因治疗的途径与策略
回输患儿体内 1~2月治疗一次, 10个月 患儿体内ADA水平达正常人的25%
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基因治疗基本过程 例2
• 逆转录病毒载体 +FⅨcDNA
重组体
5` LTR FⅨ neo SV PSO LTR 3`
①导入仓鼠细胞（CHO ）→FⅨ表达； ②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养） →FⅨ表达； ③91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体 外培养）→回植病人皮下→FⅨ基因表达，FⅨ基 表达水平达正常人的5%。 我国学者薛京伦实施的FⅨ的基因治疗， 23 是我国基因治疗成功的例子。
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5 自杀基因治疗肿瘤
• 自杀基因：是一类前体药物酶转化基因、药物 敏感基因或酶-前体药物激活基因。 • 主要存在于病毒、细菌或真菌等微生物细胞中。 • 自杀基因系统：包括一种酶和一种前体药物， 通过酶活性的表达将对人体细胞无毒性的前体 药物转化为对细胞有很高毒性的物质。 • HSK-tk
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THE EDN!
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抑癌基因p53：
①正常细胞内主要抑制细胞生长周期，抑制细 胞分裂和诱导细胞凋亡。
②正常细胞中p53半衰期短，含量低。 ③肿瘤细胞中p53表达量增加，但多数没有活 性。
④p53是至今临床发现的与肿瘤发生相关率最 高的抑癌基因。
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2 针对癌基因的基因治疗
反义癌基因治疗：同源mRNA互补
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♫ 为何会得癌症？ ♫ 为何基因修饰瘤苗具有抗癌作用？ ♫ 制备方法？
♫ 安全性好
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基因修饰瘤苗
• ①在恶性肿瘤的治疗过程中，常常会出现手术后 复发或肿瘤向远处转移的情况。 • ②将外源基因导入肿瘤细胞，改变细胞的致瘤性 和增强免疫原性，有利于被机体T淋巴细胞识别， 并激发特异性细胞毒反应，从而消灭肿瘤细胞。
基因工程操作都在体外完成，基因治疗需将基因导 入人体细胞，所以在有效性和安全性方面要求更高。
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鸟氨酸转氨甲酰酶
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基因治疗的发展
• 美国，世界上开展基因治疗最早的国家。1990 年9月14日，第一例正式批准的基因治疗实验 开始进行，4岁ADA缺陷病人 • 2009年，佛罗里达大学三位患有Leber先天性 黑矇(LCA)2型的遗传性盲患者