MS +（2.0mg/L）6-BA + （0.3mg/L）NAA + （30g/L）蔗糖 + （400mg/L）头孢霉素 +
（50mg/L）卡那霉素 + （7.5g/L）琼脂
PH：5.8-6.0
5 烟草生根培养基：固体 MS 培养基
2、农杆菌侵染菌液的制备方法：
1 超净工作台紫外灯灭菌 15min，接种环酒精灯灼烧灭菌备用
2 铺皿：LB（50mg/L 卡那霉素+25mg/L 利福平）
3 划线：用接种环沾取预转化的农杆菌菌液于铺好的培养基划“之”字或者“#”字
4 封皿，做标记
（5）28℃恒温培养 1d-2d
1
（6）用无菌刀刮取适量菌体于 50mL 液体 MS 培养基中，28℃，180r/min 震荡培养 1-2h 至 均匀悬浮液，紫外分光光度计测量菌液的OD600值，用液体MS 调整浓度至OD600值约为0.8-1.0 为宜，备用。 3、外植体的制备
农杆菌介导的烟草转基因技术
一、实验目的
了解转基因的基本原理及操作方法。
二、基本原理
根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农 杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为 Ti 质粒。野生型农 杆菌的 Ti 质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是 T-DNA 区（transferred DNA region）， 含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在 T-DNA 的切割、转移与整合过程中起 作用。农杆菌可将 T-DNA 插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。 我们将目的基因插入到经过改在的 T-DNA 区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞 的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
三、材料
1、植物材料：烟草无菌苗
2、农杆菌与载体：EHA105；PBI121
四、方法步骤
1、试剂的配制
1 LB 固体培养基：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠 10g/L，H：5.8-6.0
3 烟草共培养培养基：固体 MS 培养基
4 烟草筛选培养基：
从共培养基上取下叶片，预 400mg/L 的头孢水中浸泡 5min，浸泡两次，然后用无菌水 清洗三次，无菌滤纸吸干叶片表面的水分，接种于筛选培养基上，25℃光培养，期间每 20d 继代一次，直至再生出芽。此时将再生芽切下置于生根培养基上诱导生根。
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准备生长 20d 健壮的烟草无菌苗，挑选接近植株顶端，完全舒展开且较大的叶片。将叶 片平铺在无菌滤纸上，左手拿镊子，右手拿刀。用镊子固定叶片，刀片切去也边缘和叶脉， 然后将叶片切成 5mm×5mm 的正方形，备用。 4、侵染与共培养
取制备好的侵染菌液 50mL 于三角瓶中，将切好的烟草叶片进入其中，摇晃使菌液与叶 片充分接触，侵染 10min，期间摇晃三角瓶数次。然后用镊子将叶片夹出，放在无菌滤纸上， 吸干其表面的菌液，接种于共培养基上，于 25℃培养室暗培养 3d。 5、筛选培养和生根培养