抗体酶的研究及其应用郝文杰生物化学与分子生物学 201421191526 摘要：抗体酶又称催化性抗体，是具有催化活性的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，它可促进许多用普通化学方法很难完成，或者天然酶尚未能催化的新奇转变，特别是自然界不存在的高效催化剂，对生物学、化学和医学等多种学科有重要的理论意义和实用价值。

本文就催化抗体的结构、性质、产生方法、筛选方法、酶学特征及应用进行了综述。

关键词：抗体酶；催化；高度选择性；催化剂；实用价值；结构抗体酶是具有催化性质的抗体。

从1883年Payen和Personz发现第一个酶以来，自从1986年Schultz和Lerner首次证实由过渡态类似物为半抗原，通过杂交瘤技术产生的抗体具有类似酶的催化活性以来，直至20世纪80年代初期，整整一个半世纪，发现的酶已经超过了4000种[1]。

1986年，Schultz和Lerner 同时在《Science》周刊上发表了他们各自独立领导的研究组对抗体酶的研究报告，并将之命名为Abzyme。

Abzyme本质为免疫球蛋白（Ig），只是在易变区被赋予了酶的属性，故又被称为催化抗体。

酶的催化机制在于它能结合底物产生过渡态，降低能垒，改变化学反应的速度。

抗体酶显示出在许多领域的潜在应用价值，包括许多困难和能量不利的有机合成反应，前药设计，临床治疗，材料科学等多个方面。

抗体酶这种兼具抗体和酶的性质的崭新物质，它集生物学、免疫学、化学于一身，它的发现打破了只有天然酶才有的分子识别和加速催化反应的传统观念，为酶工程学开创了新的领域，同时也为验证天然酶的催化机制，进行酶的人工摸拟，以及研究天然酶催化作用的起源提供了很好的帮助。

抗体酶的应用前景是十分广阔又充满希望的。

1.抗体酶的发展历史抗体酶(abzyme),又称催化抗体(catalytic antibody),是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体,它既具有相应的免疫活性,又能像酶那样催化某种化学反应[2]。

1946年,Linus Pauling阐明了酶的催化实质,同时指出稳定的反应过渡态类似物可以竞争性抑制酶活性的实质。

酶之所以具有催化活力是因为其和反应的过渡态(底物激活)发生特异性结合,形成酶-底物复合物,大大降低了反应的活化能,从而加速了反应速率。

酶产生的生物局限性是酶催化高效性无法普遍化的局限因素,突破限制就能人为地控制酶的产生。

高等动物的免疫系统为我们提供了方便[3]。

1969年,Jencks提供免疫诱导产生抗底物基态的抗体,该抗体具有类似酶的催化活性,这个抗体酶设想的提出,使得任何一个化学反应构造一个专一性催化酶成为可能。

然而在抗体酶的研制中遇到了两个问题:1.底物基态瞬间存在,无法提取。

根据Pauling的酶的竞争抑制实质,可以构造过渡态的稳定类似物作为实际抗原。

2.抗原在分子量上有一定的要求,所以一般将类似物作为半抗原接到适当载体上构成抗原。

1975年,Kohler和Milstein 发明了具有历史意义的单克隆技术,使抗体酶的获得成为可能。

1986年,美国Scripps Clinic研究所的R.A.Lerner等宣布研制成功首例对羧酸酯水解具有催化活力的抗体酶。

同年,加州大学的P.Schultz等宣布单克隆的MOPC167抗体可以催化对硝基苯氧基羧基胆碱的水解。

抗体技术的发展经历了三个阶段,一是通过免疫动物产生血清多克隆抗体;二是细胞工程阶段,即用杂交瘤技术产生单克隆抗体;三是利用基因工程途径表达和改造抗体。

2.抗体酶的催化作用机理抗体酶是生物体受抗原诱导产生的具有催化能力的抗体,其在结构上与抗原高度互补并能与之特异结合。

通过设计化学反应过渡态或中间体类似物作为半抗原,诱导机体产生抗体,产生的抗体能特异性地识别过渡态分子,降低反应的活化能,达到催化反应的目的。

抗体酶和所有的抗体一样,都是由两条轻链和两条重链构成,抗原与轻链和重链的可变区特异性结合,因此可变区的氨基酸的排列顺序决定了抗体分子的特异性,其本质是一类具有催化活性的免疫球蛋白,可变区赋予其酶的属性,所以也称为催化抗体。

单一模拟物(半抗原)诱导产生的多种催化抗体,其轻重链可变区具有高度同源性,氨基酸序列的不同表现为亲和力高低及催化能力大小的差异。

按照酶的过渡态学说,抗体酶可能是通过可变区与过渡态结合并使之稳定,提供易化旁路,从而加速反应的进行,有人认为轻链主要介导催化活性,而重链主要起结合作用和调节动能,其中影响活性的区域主要是CDR3区。

抗体与酶都是蛋白质,且都能高度选择性地与靶分子结合,但酶的种类仅有几千种,而抗体的种类可达千万种以上。

抗体酶的发现打破了只有天然酶才有分子识别和加速催化反应的传统观念,为酶工程学开创了新的领域。

抗体酶可催化趋向性反应及非趋向性反应,后者可能分为两种情况:一是在放热分解反应中控制反应构象,使多产物反应转变为单产物生成为主的反应;另一种情况是降低反应中过渡态能障。

但抗体酶缺少天然酶的韧性或扭曲性,没有天然酶所具有的底物去稳作用,而可能只起稳定过渡态的作用[4]。

不同方法制备的抗体酶作用机理不尽相同。

如化学突变法制备的抗体酶直接作用于底物;有的抗体酶与天然的蛋白水解酶类似,具有相似的活性催化位点。

目前抗体酶催化的反应类型比较广泛,除目前研究较多的酯水解反应外,还可以催化一些交换合成等反应。

3.抗体酶的制备方法目前抗体酶的制备方法主要有杂交瘤技术,抗体结合部位修饰法,克隆免疫反应因子的基因等多种方法。

3.1杂交瘤技术经体内免疫后再进行细胞融合是制备抗体酶的一种传统方法。

杂交瘤技术的基本原理是用不能在培养液中生长的但能产生抗体的脾脏细胞,与能在培养液中生长的骨髓瘤细胞进行融合,融合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养,通过选择培养,以获取能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。

再把这些细胞单克隆化,即繁殖成母体的同一细胞或形成菌落。

这些菌落能够产生单一均匀的抗体,可用于进行单克隆抗体的扩大生产。

对这些菌落用酶联免疫吸附法(ELISA)等方法加以筛选。

该制备方法的关键是要有合适而稳定的过渡态模拟物作半抗原,以产生与过渡态高度亲和的抗体酶。

由于大多数反应过渡态类似物的分子量较低,即所谓的半抗原,他们本身免疫原性很弱,必须与某种载体偶联才能表现免疫原性。

本方法所得到的抗体酶的催化能力的高低,在很大程度上取决于化学模型物的设计,现在应用的设计策略包括:诱导和转化设计,反应免疫,“潜过渡态”半抗原设计等等[5]。

3.2抗体结合部位修饰法将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位,一般可采用两种方法:即选择性化学修饰法和基因工程定点突变法。

抗体酶和酶一样也可以用化学修饰的方法加以改造。

对抗体酶进行结构修饰的关键,是找到一种吻合的方法在抗体结合位置或附近引入酶的催化基团或辅助基团,如果引入的催化基团与底物结合部位取向正确空间排布恰到好处,就能产生高活力的抗体酶。

为提高抗体酶的催化能力,可采用邻近效应,静电催化,应变,功能团催化等方法,在抗体结合位点引入催化基团。

基因工程定点突变法是利用位点专一性突变引起抗体结合部位氨基酸的改变,能在抗体结合部位换上有催化作用的氨基酸,进而改变抗体酶的催化效率。

目前,定点突变的方法己成为提高抗体酶活性的一种常规方法。

3.3克隆免疫反应因子的基因通过PCR技术克隆出全套免疫球蛋白的可变区基因,建立单独产生重链和轻链的噬菌体文库,然后再通过每个载体中存在的非对称限制位点使它们随机地将基因的轻重链结合,这些含有上百万个高水平表达的轻链和重链片段的文库在大肠杆菌中表达和组装,就可大量制造Fab片断了。

这样的文库在保留亲本单克隆的识别和亲和特性的基础上利用了免疫因子的多样性,通过这种方法我们可从上百万种可能性中选择抗体酶。

4.抗体酶的设计4.1诱导法这是抗体酶的传统制备方法。

选择合适的反应过渡态类似物作为化学模型物,与载体蛋白偶联后免疫动物,使宿主产生抗体,再利用杂交瘤技术来筛选和分离,得到具有催化活性的单克隆抗体就是抗体酶。

用单克隆化的杂交瘤细胞就能进行单克隆抗体的扩大生产。

由于多数反应过渡态类似物的分子量较低,即半抗原本身的免疫原性很弱,必须与某种载体偶联才能表现免疫原性。

目前最常见的载体蛋白包括牛血清蛋白(bovineseurmalbomni,BSA)和钥孔血蓝蛋白(keyholelilnpethemoeynain,KLH)[6],所得到的抗体酶的催化能力的高低,在很大程度上取决于反应过渡态类似物,即半抗原的设计。

要求通过半抗原的设计,产生最优化的抗体催化剂,实现与免疫球蛋白结合口袋的互补[7]。

现已应用的设计策略包括:过渡态类似物设计、诱导和转换设计、反应免疫、“潜过渡态”半抗原设计等[8]。

4.2工程抗体催化法工程抗体催化法借助基因工程和蛋白质工程技术,对抗体进行改造,引入催化性,将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上,也可以针对性地改变抗体结合区的某些氨基酸序列,以获得高效的抗体酶[9]。

目前,定点突变的方法已成为提高抗体酶活性的一种常规方法。

此外,对抗体结合口袋中的氨基酸残基进行随机突变,再用合适的体外筛选方法,就可获得高活性的抗体。

随着噬菌体抗体库技术的完善,可根据需要构建适当序列的基因片断,绕过免疫学方法,构建全新的抗体酶。

在此基础上,人们又发展了噬菌体展示技术[10],这种技术将组建亿万种不同特异性抗体可变区基因库和抗体在大肠杆菌中功能性表达,与高效快速的筛选手段结合起来,彻底改变了抗体酶生产的传统途径,用工程抗体催化法生产抗体酶,不需要进行细胞融合以获得杂交瘤细胞,并且可筛选具有特定功能的未知结构,具有生产简单、价格低、抗体的免疫原性较低的优点,并易获得稀有的抗体。

4.3拷贝法用已知的酶作为抗原免疫动物,通过单克隆技术,制得该种酶的抗体。

以此种抗体免疫动物,再次采用单克隆技术,经筛选与纯化,就可获得具有原来酶活性的催化抗体[11]。

因为抗原和由其诱导产生的抗体具有互补性,经过二次拷贝后,就把原来酶的活性部位的信息翻录到抗体酶上,使该抗体酶具有高选择性地催化原酶所催化的反应的能力。

4.4化学修饰法对抗体进行化学修饰,引入酶的催化基团或辅助基团,如果引入的催化基团与底物结合部位取向正确、空间排布恰到好处,就能产生高活力抗体酶。

为提高抗体酶的催化能力,可采用邻近效应、静电催化、应变、功能团催化等法,在抗体结合位点引入催化基团[12]。

对抗体酶进行结构修饰的关键,是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基团。

5.抗体酶的应用5.1在医学领域的应用随着对抗体酶研究的深入进行,抗体酶越来越显示出其在医学领域中的潜在应用价值。