细胞培养的方法与步骤
1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。

同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。

（可放在抽屉中，防止紫外照射）
换液
2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。

3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。

4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。

5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。

6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。

传代
2．拿出细胞，开口，烧，倒液。

3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。

4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。

消化程度是细胞不能滑落，要吹落。

500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。

5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁）
6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次）
7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。

8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。

9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。

80微升，100微升都可以。

冻存
8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。

9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。

10．放在4℃30分钟。

11．放在冰水混合物中10分钟。

12．-20℃中放置1~2小时（经验值是不超过1.5小时）
13．-70℃中过夜，（最多可存放7~8个月）
14．放入液氮。

注意：传代前一天换液（可换可不换）
冻存前一天换液（必换）
血清灭活: 56℃30分钟水浴。

细胞培养相关用品：
1．84消毒液：1ml“84”用双蒸水进行稀释，只1000ml为止。

2．灭菌物品：至少包两层121℃20分钟
3．PBS灭菌时瓶口胶塞插针头，而不是用塑料袋包。

以有利于加温后瓶内水蒸气能够排出瓶外。

4．冻存液的配方：
胎牛血清（FBS）20%
DMSO 10%(灭菌)
双抗1：1000稀释（保存浓度：1×100000u/ml）
(工作浓度：100u/ml)
双抗是PG（青霉素）和ST(链霉素)
5．包板多需赖氨酸0.1mg/ml
室温5min/板（5ml）
灭菌去离子水洗三遍。

超净台吹干
6．PBS配方0.1M（cell培养用）1000ml 500ml
Nacl 8g 4g
Kcl 0.2g 0.1g
Na2HPO4.12H2O 3.14g 1.57g
KH2PO4 0.24g 0.12g
PH值调到7.3~7.4之间。