细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细
胞的过程。

细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。

一、实验前准备
实验开始前，水浴箱调节至36度恒温。

取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。

消毒双手和超净台。

取约1ml 细胞完全培养基放于15ml 离心管中。

水浴箱调节至40度恒温，由液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。

整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。

注：解冻到0度时（即冻存管里还有最后一点冰）立刻转移到含培养基的离心管中。

然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后补全生于的培养基到细胞瓶中。

二、制备细胞悬液
吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，吸取1ml培养液加入冻存管，将剩余细胞全部吸入离心管中。

上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。

离心：1000rpm，室温离心3min。

注：细胞复苏后最好等几分钟再离心，因为冻存前加了胰酶消化，对细胞造成一定损伤，复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。

三、细胞培养
离心后，倒掉上清液，缓慢操作，不要倒掉底部的细胞沉淀。

向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液。

培养瓶内加入4ml 完全培养基，细胞悬液加入培养瓶内，左右前后轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱中培养。

24-48 小时后换液或传代继续培养，换液传代的时间由细胞情况而定。

四、注意事项
1、解冻速度要快
在常温下，冻存液中的DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻
存液完全融化。

如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。

2、一次复苏细胞不宜过多
细胞在解冻时，需要迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

并且一次复苏细胞过多，容易忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

3、培养瓶上注明细胞类型，日期，人名。

当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释，分种成多瓶，细胞才能继续生长。

这一过程就叫传代。

一、传代前准备
实验开始前，紫外线照射超净工作台30min，以进行工作台的消毒。

水浴箱调节至36度恒温。

取细胞完全培养基，PBS，胰酶，放于水浴箱中预热30min。

二、胰酶消化（洗瓶+消化+吹打+终止消化+离心+去上清）
从培养箱中取出待传代的细胞，75%酒精进行瓶口消毒，倒掉培养细胞的旧培养基。

PBS缓冲液1-2ml洗去残留的旧培养基。

弃去PBS,加入1ml胰酶。

培养瓶放入细胞培养箱，开始计时（消化时间具体依细胞而异）。

倾斜瓶身，可见细胞流沙样滑落，（或放入显微镜下观察，所有细胞变圆，且部分细胞飘动）立即拿入超净台内，用无菌吸管轻轻吹打细胞表面，注意吹打全部培养表面，加入1ml 细胞完全培养基终止消化。

吸取所有细胞悬液放入15ml 离心管内。

1000rpm，室温离心3min。

三、制备细胞悬液及培养
倒弃上清液，不要倒掉底部的细胞沉淀。

向离心管内的细胞沉淀加入适量完全培养基。

吹打混匀，吹打过程中尽量不要产生气泡。

一般复苏后细胞按照1：2比例进行分瓶，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱内继续培养（其他情况下，视细胞种类和生长状况而定）。

四、结果观察
第二天可观察细胞贴壁生长情况，细胞培养换液时间一般为2～3d，根据细胞生长的状态和实验要求来确定。

五、注意事项
1、严格无菌：
传代培养时要注意严格的无菌操作，并防止细胞之间的交叉污染。

2、适度消化：
消化过程中要不断观察，消化过度会对细胞造成损害，消化不够则难于将细胞解离下来。

4、吹打细胞动作要轻柔：
吹打时用力过猛会损伤细胞。

对贴壁细胞消化后的吹打过程要有序进行，尤其是器皿的四角处，确保瓶皿底壁各处的细胞都被吹打脱离。

5、传代次数不宜过多：
传代数是指对培养物传代的次数，它不等于细胞分裂的次数或细胞的代数，而仅代表传代操作的次数。

传代对细胞的影响或伤害程度仅次于将活细胞从生物体内取出并进行原代培养的程度。

只是因为传代后的细胞生长并不像刚开始原代培养时那样缓慢。

每经过一次传代，细胞的生长环境就相应发生一次较大变化。

体外生长的细胞若处于动荡的生活环境中，细胞的遗传特性往往容易发生改变。

经过多次传代培养的细胞，往往容易转化为恶性细胞。

因此，传代对细胞生长和性状会产生不利影响，一般情况下要尽可能减少传代次数。

细胞冻存
细胞生物学研究中，为了更好而长期地研究细胞生物学功能，需要将良好状态的细胞保存起来，以备将来使用。

在不附加任何保护剂下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH 改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。

如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。

在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。

贮存在负130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞冻存时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，待复苏时重新进入生长分裂周期。

一、实验前准备
实验开始前，紫外线照射超净工作台30分钟。

采用通风机通风3分钟。

水浴箱调节至36度恒温。

取细胞完全培养基、PBS、胰酶等，放于水浴箱中预热30min。

配置细胞冻存液：冻存液应该提前配制，置于室温备用，防止临时配制产生的热量损伤细胞，按血清:DMSO=9:1的比例配置细胞冻存液，其中加大冻存液中血清的比例对于
保存某些脆弱的干细胞以及一些比较珍贵的细胞很有好处的。

按比例加好冻存液组分后，轻轻吸打混匀，置于室温下待用。

二、胰酶消化（洗瓶+消化+吹打+终止消化+离心+去上清）
从培养箱中取出细胞，倒掉培养细胞的旧培养基。

PBS缓冲液1-2ml洗去残留的旧培养基。

弃去PBS,加入1ml胰酶。

培养瓶放入细胞培养箱，开始消化计时。

消化完成后，吸取所有细胞悬液放入15ml 离心管内。

1000rpm，室温离心3min。

四、细胞冻存
取出冻存管，注明细胞名称、培养基和血清种类浓度，代数、日期。

离心后，弃掉上清液，按血清:DMSO=9:1的比例，加入血清和DMSO并吹打混匀。

（25T 培养瓶细胞密度约为90%时，方可配置1ml冻存液用于细胞冻存，一个两毫升冻存管装入1至1.5毫升细胞冻存悬液为宜。

）
严密封口后，进行程序性降温冻存：首先4度30分钟，负20度2小时，负80度
过夜，最后进行液氮保存。

五、注意事项
1、细胞活力及浓度
细胞应在生长良好、致密度约为80-90％、数目一般为106-107/ml的状态下冻存。

2、注意冷冻保护剂的操作
混匀DMSO要快，因为DMSO对细胞有毒性，混合后应尽快冻存。

细胞中加入冻存液后，一定要混匀，防止DMSO沉淀。

3、实行细胞慢冻的原则
缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶，导致细胞损害。

相反，若不缓慢冷冻，造成的结晶就大，大结晶会引起细胞膜、细胞器的损伤和破裂。

复苏
过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。