基因转导技术（14周）基因转移技术将外源基因转移到受体菌或细胞内,在细胞内实现转入基因的扩增或表达的技术。

它是重组DNA、基因功能研究、基因治疗的关键技术之一方式：转化感染转染转化（Transformation）：将质粒或其它外源DNA 导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程感染(Infection): λ噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，然后才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增转染(Transfection):是转化和感染两个词构成的新词，指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的遗传表型的过程。

如电穿孔、磷酸钙共沉淀、脂质体等基因敲除（knock out of gene）：利用基因打靶技术，用无功能的外源基因转入细胞与基因组中同源序列进行同源重组，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活，这一技术叫基因敲除基因敲进（knock in of gene）：利用基因同源重组，将外源有功能的基因转入基因组中不存在或已失活的细胞中与其基因组中同源序列进行同源重组，在细胞内获得表达，这一技术称为基因敲进统称为基因打靶技术（Gene targeting）常规转染技术可分为两大类：瞬时转染：外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析稳定转染：也称永久转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。

外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，新霉素抗性基因，潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

基因转导技术的分类化学方法：磷酸钙沉淀法DEAE-葡聚糖1. 磷酸钙沉淀法目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，吸附在细胞膜表面，由细胞内吞作用进入到靶细胞的细胞中，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达方法简单，但转化效率低Ca2(PO4)2+DNA →混合微细颗粒2. DEAE-葡聚糖和聚季胺盐转染法θDEAE-葡聚糖或聚季胺盐均可同带负电的DNA分子聚合,形成复合物，与靶细胞作用而传递进入细胞内θDEAE-葡聚糖具有促进靶细胞摄取DNA的作用物理方法：脂质体介导的转染电击转染法基因枪技术显微注射法1. 电穿孔法（electroporotion）将细胞置于高压脉冲电场中，通过瞬间高压脉冲电压使细胞产生可逆性的穿孔（打孔），周围基质中的外源DNA可渗进细胞，进而表达电击转染技术原理电击转染技术是利用电转导仪在一定的电压、脉冲时间等参数下, 将外源基因导入到细胞中的一种有效方法。

它是将细胞置于脉冲电场中，瞬间高压脉冲，这就有可能可逆性地在细胞膜上打出微孔（打孔）具有操作简单, 耗时少, 节省成本等优点, 但对细胞的损伤较大, 对电压非常敏感, 所以需要有一个合适的电压, 既能使外源基因导入又尽可能让最少量细胞受损伤影响电击转染的因素：脉冲电压：最适电压约在200伏左右电导电路的电容：电压脉冲等于电容量和缓冲液电阻的乘积。

缓冲液的盐度：高盐度减小了电场的阻力,导致电脉冲的作用时间变短，产生的膜孔直径变小DNA浓度：DNA浓度上升，转导率上升细胞数量：合适电压与细胞的大小成反比温度2. 脂质体介导的转染脂质体是由双分子层组成的闭合囊泡,通过细胞的内吞或吞噬作用, 将所携带的目的基因导入细胞中脂质复合体没有免疫原性, 组织毒性较小, 而且转染脂质体也易于制备, 因此脂质体转染已成为现今用于基因转移的最常用方法阳离子脂质体介导转染的原理将DNA或RNA包裹于脂质体内, 然后经脂质体与细胞膜的融合或者细胞的内吞作用导入阳离子脂质体的表面带有正电荷,其介导的转染是基于和阳离子脂质体之间的离子相互作用, DNA通过形成一个脂质体-DNA复合物再被细胞捕获并最后表达脂质体复合物进入细胞的方式吸附细胞内吞作用介导的融合直接与细胞质膜融合两个关键性特点使得Lipofectamine2000的转染步骤快速简便♠DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中♠转染后不需要除去Lipofectamine2000试剂。

对于96孔板培养，不再需要提前一天进行细胞铺板，而可以直接在平板中制备复合物，然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了，这样进一步减少了转染时间阳离子脂质体试剂转染注意事项有血清时的转染在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成培养基中的抗生素抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。

降低了细胞的活性，导致转染效率低脂质体介导转染与电穿孔技术合用如果将脂质体-DNA复合物与电穿孔技术联用, 将有助于提高基因传递的靶向性和肿瘤部位的基因摄取量3. 显微注射法（microinjection ）显微注射法（microinjection）是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内体外利用打靶载体对ES细胞进行基因敲除或敲入，再将ES细胞显微注射入囊胚中，移植宿主显微注射法转外源基因没有长度上的限制，目前已证明数百kb之DNA片段均可以成功产制出转基因动物。

其缺点是设备精密而昂贵、操作技术需要长时间的练习，以及每次只能注射有限的细胞。

4. “基因枪”技术“基因枪”技术又称:粒子轰击(particle bombardment)，高速粒子喷射技术( High-velocity particlemicroprojection )or基因枪轰击技术( gene gun bombardment )美国Comel大学生物化学系John.C.Santord等1983年研究成功，1987年应用基因枪根据动力系统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。

其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞（细胞、组织或器官），由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，实现稳定转化的已在烟草、水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、菜豆、洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等多种作物上成功；初步应用：基因治疗和抗体制备基因枪法(Biolistic-bombardment)：多用于植物细胞或体内直接转导生物学方法：逆转录病毒感染腺病毒感染慢病毒感染是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞目前最常用的病毒载体有：逆转录病毒、腺病毒、慢病毒等用作载体的“病毒”都是经过人工改造的假病毒，需要在体外包装成具有感染性的完整病毒颗粒，才可感染宿主细胞病毒感染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必需的全套酶系统，适用于介导基因转移目前应用最多的最成功的是逆转录病毒（retrovirus ）逆转录病毒载体 优点① 高效感染宿主细胞，转染率可达100% ② 病毒基因和所载的外源基因都可能表达 ③ 宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留逆转录病毒载体 缺点 ① 病毒基因容量有限，一般只能插入7kb 左右片段② 病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入外源基因可能不适当的表达③ 逆转录病毒有潜在致病性，使受体细胞癌变根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR 和ψ包装信号各转染方法与细胞相互作用的机制以及它们传递分子的类型基因转导技术在生物医学研究中的应用 研究基因功能转基因动(植)物的制备 疾病的基因治疗 基因工程药物的生产基因序列测定及序列分析（13周）主要内容：Ⅰ基因组、基因Ⅱ核酸Ⅲ核酸的结构与功能Ⅳ核酸酶与限制性核酸内切酶ⅤDNA序列分析(DNA一级结构测定)Ⅵ基因组序列解析Ⅶ基因组序列解析举例ⅧRNA测序Ⅰ基因组、基因基因组就是一个物种中所有基因的整体组成。

任何一条染色体上都带有许多基因，一条高等生物的染色体上可能带有成千上万个基因，一个细胞中的全部基因序列及其间隔序列统称为基因组（genomes）。

基因组有两层意义：遗传物质和遗传信息。

要揭开生命的奥秘，就需要从整体水平研究基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系。

各物种基因组特点：病毒基因组结构特点1、基因组相对较小且大小相差较大。

2、不同病毒只含一种不同结构核酸。

3、由连续的或不连续的多核苷酸链组成。

4、基因重叠（包含型、交叉型）。

5、大部分用来编码蛋白质（相关基因簇、单倍体基因组、与寄主基因组结构特征相似）。

细菌基因组结构特点1、染色体基因组通常只由一条环状双链DNA 组成。

2、具有操纵子结构。

3、重复序列少。

4、内含子所占比例小。

5、具有编码同工酶的同基因。

6、基因不重叠。

7、具有多种功能的识别区域。

8、在基因或操纵子序列末端具有特殊终止序列。

真核生物基因组结构特点1、体细胞的基因组是双份的真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内的基因组是双份的(即双倍体)，即有两份同源的基因组。

2、转录产物是单顺反子即一个结构基因转录、翻译成一个mRNA分子，一条多肽链。

3、存在大量重复序列即在整个DNA中有许多重复出现的核苷酸顺序，重复序列长度可长可短，短的仅含 2 个核苷酸，长的多达数百、乃至上千。

重复频率也不尽相同。

高度重复序列：长度：几个～几千个bp；拷贝数：几百个～上百万个首尾相连，串联排列，集中分布于染色体的特定区段（如端粒，着丝粒等），也称卫星DNA。

序列中G-C含量高于DNA的其它结构。

中度重复序列：一般分散于整个基因组中；长度和拷贝数差别很大。

rRNA、tRNA、组蛋白等的基因，大多为中度重复序列。

在中度重复序列中，有一类可移动的片段，称为逆转座子。

单拷贝或低度重复序列：在整个基因组中只出现一次或很少几次的核苷酸序列。

在真核细胞中，除组蛋白以外，其它所有蛋白质都是由DNA中这种单拷贝序列决定的。

该序列大小不等，每一个顺序决定一个蛋白质的结构，称之为结构基因。

动物中约占50％；植物中约占20%，因此所含信息量最大。

在人基因组中占约60～65%。