第二节 生物大分子相互作用分析技术
1. 研究思路
2. 分类
3. 技术介绍
生物大分子相互作用分析研究思路
鉴定与目标分子相 互作用的所有可能 大分子
详细描述其生物功能 及相互作用对其功能 的影响
鉴定出相互作用且在生理 状态下得到了验证和合理 的解释
生物大分子相互作用分析技术
GST 融合蛋白技术(GST pull-down) 免疫共沉淀(Immunoprecipitation, Co-IP ) 串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification，TAP) 酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid) 噬菌体展示(Phage display)
Bait:
已知蛋白 + activation domain
Transformation
Screening
DNA extraction
转入同一个酵母菌中
DNA sequencing
Target 与Bait可互换
Yeast Two-Hybrid Assay
HIS
his- leu- trp-
DBDbait
2. 免疫共沉淀
（ immunoprecipitation，Co-IP ）
——非常有效地用于鉴定细胞内生理上的蛋白质
相互作用的分析技术
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以
抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白 质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细 胞内生理性相互作用的有效方法。
trp
lacZ
AD fish
leu
reporter
his
nucleus
Measurable product
酵母双杂交方法的优势及缺陷
优势：
采用酵母菌株 敏感度高 蛋白折叠 易于筛选 应用范围广
缺陷：
核内作用 假阳性 假阴性 转化率
酵母双杂交方法的应用

第六章 生物大分子相互作用
分析技术
基础医学院
刘 芸
主要内容
第一节 生物大分子相互作用分析的意义 第二节 常见的生物大分子相互作用分析方法 第三节 生物大分子相互作用分析新进展
（FRET、SPR）
引言
细胞结构 cell

真核生物细胞 原核生物细胞
eukaryotic cell

prokaryotic cell
Bait
Controls
R
Wash
Prey
R
Add prey
R
Add prey S C
R
Wash
R
Wash
R
Elution
R
Elution SDS-PAGE gel Analysis Analysis
实验流程
GST融合蛋白 + X GST 谷胱甘肽-琼脂糖微珠
Y
细胞裂解物 tube X GST Y 4℃下孵育2h
相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获
蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋 白、表达系统以及体外转录翻译系统等 方法获得。
GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)
GST pull-down assay
Purification of protein
GST fusion protein
蛋白质多聚体(polymer)
蛋白质-DNA复合物(protein-DNA complex) 蛋白质-脂质复合物(protein-lipid complex) 蛋白质-RNA复合物(protein-RNA complex) DNA-DNA复合物(DNA-DNA complex)
……
引言
原核生物细胞结构
质膜 肽聚糖
被膜
引言
真核生物细胞结构
植物细胞
动物细胞
细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核
引言
细胞中的大分子
Macromolecules in Cells
The approximate composition of a bacterial cell.
第一节 生物大分子相互作用分析的意义
分子水平
DNA sequence
?
Proteins Structure Function
All Cell
基因表达的调控层次
Inactive mRNA
mRNA degradation control translation control
DNA
Primary transcript
mRNA
mRNA
Transcriptional control
诱饵 蛋白质
Protein A/G Sepharose
离心
离心
SDS-PAGE
基础：细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内许多蛋
白质之间的结合保持下来。
要求：在一系列操作过程中保持蛋白质复合体不变
缺点：可能检测不到细胞内处于动态平衡中的低亲和与
瞬间的相互作用,存在着免疫球蛋白的污染，需要培养大 量的细胞
局限：仅应用于从细胞中溶解出来仍存在于生理复合物
中的蛋白质
Co-IP 应用

鉴定已知蛋白质相互作用的检测 鉴定新蛋白质间的相互作用

举例
免疫共沉淀验证两种已知蛋白质的 相互作用
+X-HA
Y-GFP Y-GFP
IP:
Y-GFP
HA
control IgG
Anti-GFP Anti-HA Anti-GFP
基本原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整
细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留 了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在 体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
Y X
agarose
G
agarose
G
agarose
G
实验设计思路
实验流程
传统方法 交联方法
诱饵 蛋白质
＋
＋
抗体
Protein A/G Sepharose
Glutathione column
Glutathione bead
Tags Pull-Down
Resin——树脂
方法的组成
Bait——诱饵蛋白 Prey——捕获蛋白 Tags ——标签（GST, His, Flag, HA, MBP）
R
tag bait
prey
实验设计思路
Pull-down experiment
GST pull-down 应用

鉴定未知相互作用的蛋白 鉴定预测的或已知的相互作用

举例
GST pull down验证两种已知蛋白质 （X-Y）的相互作用
Y-GST
input
X-GST
input
Y-GFP
105kD
GST
GST +
+
+ Y-GFP
X-GFP +
nti-GFP
Anti-GFP
3. 一个或多个报告基因（如控制氨基
酸合成的基因、大肠杆菌的lacZ基因 等），位于DNA结合结构域识别的调 控区的下游。
+
reporter
Measurable product
实验设计思路
Construct target plasmid and bait plasmid
Target:
未知蛋白或将研究對象 + DNA binding domain
充分洗涤后，加入EGTA洗 脱结合物
用EGTA 洗脱
4. 酵母双杂交（ yeast two-hybrid system ）
——基于在转录水平上的直接在酵母细胞内检测蛋 白质之间相互作用的遗传学方法
基本原理： 基于对真核生物调控转录起始过程的认识。
典型的真核生长转录因子， 如GAL4都含有二个不同的结构域： DNA结合结构域（DNA-binding domain，BD）和转录激活结构域 （transcription-activating domain，AD）。 前者可识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调 节的基因的上游， 转录激活结构 域可同转录复合体的其他成分作 用， 启动它所调节的基因的转录。 二个结构域不但可在其连接区适 当部位打开， 仍具有各自的功能。 而且不同两结构域可重建发挥转 录激活作用。酵母双杂交系统利 用杂交基因通过激活报道基因的 表达探测蛋白－蛋白的相互作用。
酵母双杂交（ yeast two-hybrid system ）
三个基本组成部分
DBD
AD
+
gene
1. 表达诱饵蛋白的载体，诱饵即我们
感兴趣的蛋白，它和DNA结合结构域 融合。
DBD bait AD prey
2. 表达靶蛋白的载体，靶蛋白可以是
一。
assay）
——基于重组蛋白表达纯化技术的体外分析系统
基本原理：是将靶蛋白-GST融合蛋
白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为 与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱
饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获
与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白), 洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析, 从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选
Post-transcriptional control
protein
active protein
Post-translation control
nucleus
cytoplasm
生命机制
Protein complex
Signaling net work