分析
8
Copyright ? 2013. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.
荧光原位杂交 (FISH) 检测——以 HER2 为例
FISH 检测乳腺癌细胞HER2 扩增代表性图例
无扩增
无扩增
高倍扩增
扩增ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
DNA序列测定的意义
DNA 的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如 在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因 表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求 对DNA一级结构的详细了解。
免疫组化染色
原理：根据 抗原抗体反应 和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合， 再利用一抗与标记生物素、 荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根 过氧化物酶 （HRP）或碱性磷酸酶 （AKP）等的抗生物素（如链霉 亲和素 等）结合，最后通过 呈色反 应或荧光 来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内 发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分 布和含量。
桑格测序原理
? 原理：利用 DNA聚合酶，以待测 单链DNA 为模板，以 dNTP为底物，设立四种相互独 立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的 双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP ）作为 链延伸终止剂。
? 在测序引物引导下，通过高分辨率的变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离， 放射自显影 检测 后，合成链序列 ，由此推知待测模板链的序列 。
检测方法
优势
劣势
AMRS-PCR
荧光原位杂交 FISH 免疫组化 IHC
1、灵敏度 3%-10% 2、扩增和检测同时进行，封 闭的体系，减少污染的可能性
12
Copyright ? 2013. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.
Sanger测序的流程
结果解读
ARMS法检测
扩增阻碍突变系统(ARMS) -又称等位基因特异性扩增（ASA），利用PCR引 物的3' 端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位 基因特异性 PCR扩增引物。
17
四色荧光判别ATCG 四种碱基
?激光超高分辨率照相机
?Miseq 为首个FDA批准临床的
高通量测序仪
?国际NGS 高分文章，绝大多数 使用Hiseq 平台
新一代高通量测序 (NGS)能同时检测不同形式的基因突变
Marc Ladanyi. 2015 ASCO Annual Meeting 18
检测方法比较
免疫组化是从蛋白层面看问题的，与测序不同，一个是因（ DNA），一个是果 （Protein ），所以体内出现一些未知突变，如果对蛋白功能产生影响，也是可以看出来 的。
6
0分
1分
2分
3分
荧光原位杂交（FISH）
? 定义：荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 是通过荧光标记的 DNA探针与细胞核内的 DNA 靶序列杂交，并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种 分子细胞遗传学技术。 它的基本原理是：如果被检测的染色体或 DNA 纤维切片上的靶 DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性 -退火-复性，即可形成靶 DNA与核 酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可 利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在 镜下对待测 DNA进行定性、定量或相对定位分析。
ARMS（ASA）的特点是： “只有在引物3'碱基与模板配对时才能出现 PCR扩增带，野生型的不扩增”
优势 ? ? ?
不足 ? ?
灵敏度高，重复性好，对标本突变率要求底 操作简单，仪器费用较低廉 检测时间短
仅能检测已知突变类型 不能得到具体碱基突变类型
数字微滴PCR (ddPCR )
通过将微量样品扩大倍数稀释和分液 (partitioning)，直至每个样品中所含有 的待测分子数不会超过 1个，再将所有样品在相同条件下进行 PCR扩增，并对 发生了扩增反应的样品逐个进行计数的一种技术。
数字 PCR
检测方法介绍
? 免疫组化（ IHC） ? 荧光原位杂交（ FISH） ? 桑格测序（ Sanger 测序法）
检测方法的介绍 ? 扩增阻滞突变（ ARMS）-PCR法
? 数字PCR（ddPCR ） ? 二代测序
5
Copyright ? 2013. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.
DNA 序列分析（ sanger 测序、 ARMS 法、二代测序）等 - 针对肿瘤的癌基因 /抑癌基因、生长因子及受体 , 以及肿瘤相关的某些染色体
位点异常的检测
2
组织病理学检查仍是癌症诊断的“金标准”
AC
SC
SCC
LC
3
肿瘤病理诊断治疗已进入个体化分子时代
免疫组化
FISH
二代测序
肿瘤
一代测序
ARMS
Copyright ? 2016. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved. 15
ddPCR的工作流程
新一代高通量测序 (NGS)的原理
原理是在Sanger测序方法 的基础上，用不同颜色的 荧光标记四种不同的dNTP。 通过碱基互补配对原则逐 一的添加标记过的dNTP， 每添加一种dNTP就会释放 出不同的荧光，根据捕捉 的荧光信号并经过特定的 计算机识别、转换，从而 生成相应的序列信息。
临床常用诊断技术
1
Copyright ? 2016. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.
肿瘤诊断方法
影像学诊断 ：超声， CT，MRI ，PET，PET-CT 组织细胞形态学诊断 ：
- HE染色 - 辨别肿瘤细胞及分型 免疫组化诊断 ： - 利用抗原抗体结合反应原理 - 针对蛋白类肿瘤标记物（癌胚抗原，糖类抗原， 甲胎蛋白等）的检测 - 鉴别组织来源 分子诊断 ： - 荧光原位杂交（ FISH）、基因探针及标记、多聚酶链式反应（ PCR）、