一代测序
一代测序一般指Sanger测序，是上世纪70年代由sanger和Coulson开创的DNA双脱氧链终止法测序，当初几 十个国家花了几十亿刀完成的人类基因组计划就是使用的改良版sanger测序。
Sanger测序一次可以读取600-1000bp的碱基，准确性十分之高，至今仍是正确性的金标准。该技术在当下依 然被广泛应用，比如构建载体做克隆，基因敲除等实验都可以用到。但其通量实在太低，导致在很多情况 下成本太高，难以广泛应用。
二代测序
二代测序技术，又称为Next Generation Sequencing（NGS）技术，高通量测序技术， 是为了改进一代测序通量过低的问题而出现的。刚面世时主要包括Roche公司的454技 术、ABI公司的Solid技术和Illumina公司的Solexa技术。这三种技术都极大的提高了测 序的通量，大大降低了测序成本和周期。
➢ 二代测序和一代测序最大的不同点在于其边合成边测序技术。
二代测序
二代测序
测序流动槽(flowcell)： 每个槽都有共价交联的两种oligo（P5和P7），分别与两 端的接头互补。DNA聚合酶
P5 P7
桥式PCR合成另一条链
NaOH解开双链
NaOH解开双链 后模板链被洗掉
二代测序
流动槽加入引物 Rd1 SP、DNA 聚合酶、荧光标 记的dNTP，对 第一条链测序
三代测序
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序， 并实时检测插入碱基的荧光信号。ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小 的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅 地降低了背景荧光干扰。
SMRT Sequencing Technology
➢ 单分子实时测序技术 （Single Molecular，Real Time） 原理：边合成边测序的原则，一个纳米孔的底部共价结合一个生物素分子，通过链霉亲和素，将偶联生 物素的DNA聚合酶锚定到纳米孔的底部，4种荧光标记的dNTP在碱基配对阶段发出不同光，根据光波长 和峰值可判断进入碱基的类型，磷酸二酯键形成过程荧光基团被切掉。读长跟DNA聚合酶活性保持有关， 长时间激光照射下可能蛋白变性。
的一个反应只能测150-300bp的长度，如果测双链则是300-600bp，靠着软件算法上的进步才得以可 用。 ➢ 测得长才是王道啊！由此三代测序走上了历史舞台。
三代测序
三代测序主要有两种技术：PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的纳米孔 单分子测序技术，这两种技术的测序读长都可以达到几十kb的级别，远远高于二代测序技术。
优势3 ：高准确率
SMRT 测序优势
三代测序
SMRT 测序优势
优势4 ：实时检测碱基修饰信息
测序建库
三代测序
Thank you for time
➢ 三代测序读长长，遇到大基因 组测序，在极短时间内完可成 拼接。
优势2 ：无GC偏好性
➢ 测序不受GC含量的影响，因为构建过程无需PCR反应，PCR反应GC含量高的片段比GC含量低的片段 扩增慢，所以二代测序GC含量高的片段出现概率要低。
三代测序
优势3 ：高准确率
SMRT 测序优势
。
三代测序
一代、二代、三代测序都是利用DNA聚合酶原理，DNA聚合酶催化下一个脱氧核糖核苷酸5’的磷酸和上一个 脱氧核糖核苷酸3’羟基形成磷酸二酯键，如果某个脱氧核糖核苷酸3’羟基被脱氧或者被叠氮钠修饰，则终止 反应。
缺少3'位的羟基的ddNTP结合到DNA链上，会使得后面的单脱氧核 苷酸（dNTP）无法再聚合上来，致使聚合反应终止。
流动槽加入引物 Rd2 SP、DNA 聚合酶、荧光标 记的dNTP，对 第二条链测序。
P7与流动槽 共价连接的 单链被切断 后洗掉
二代测序
➢ 合成一个碱基就用激光扫描一次，每一个簇上都形成相应的信号，然后再合成一个碱基再扫描。 ➢ 二代测序技术虽然通量很高，成本低廉，但是读长实在太短，主流的Illumina测序仪，常规模式一个簇
P5与流动槽共价连 接的单链被切断后 洗掉
化学方法切断
一轮反应只能加 上一个碱基，一 个簇只能测150300个反应。
洗掉杂质后加入 引物I7，DNA聚 合酶，荧光标记 的dNTP，对 index 1进行测 序
洗掉杂质后， DNA聚合酶， 荧光标记的 dNTP，对 index 2进行 测序，并合 成另一条链
三代测序
1GB=10亿pb
三代测序
三代测序
二代测序dNTP荧光标记在碱基上
三代测序dNTP荧光标记在5‘磷酸基团上
三代测序
① 四色荧光基团标记的dNTP加入ZMW孔中； ② 与模板序列对应的dNTP进行配对，进入ZMW孔底物检测区域，激发光照射下发射对应 的荧光，经过光学系统转化为对应的碱基识别信号； ③ 磷酸二酯键合成后，磷酸基团脱落，荧光基团随着脱落； ④ 重复①-③ 注：经过改良的DNA聚合酶每秒合成3个碱基，确保光学系统能够捕捉到相应碱性释放的荧光
一个A碱基
序引物；
I7：
第一条测序完，用I7引物测序第一条链上的index 1序列；
P5：
再用P5为引物测序第一条链上的index 2；
Rd1 SP：第二条链测序引物；
➢ 因不同的样品可以同时在一个流动槽里进行测序反应，index 1和index 2 序列可以通过加或者 不加来区分NA：采用酶或者超声波将基因组打断，然后用DNA聚合酶补平，
并在3‘加一个A碱基；
• b类人等超大片段基因组：采用转座酶，Tn5本身是一个DNA转座子的转座酶，它可以带
着自己的DNA在基因组上到处插入，酶或者超声波将基因组打断，然后随机引物进行反转录pcr，然后DNA聚合酶在cDNA的3‘加
信号。而正常的DNA聚合酶在天然状态下每秒合成100多个碱基，有的甚至达到1000多碱基。
三代测序
三代测序
优势1 ：超长读长
SMRT 测序优势
➢ 二代测序读长短，靠发软件算 法才能拼接，如果遇到大基因 组测序，有时无法在合理时间 内完成拼接。
• 有报道称山羊全基因组测序 三代测序比二代速度快了5倍。
其中Illumina公司凭借超低的测序成本和可以接受的读长，成为了目前最主流的二代测 序公司，其测序成本近五年来从几千元1G（1G即10亿碱基）降到了到今天的40多块钱。
• 化学试剂三羧基乙基膦（TCEP）淬灭荧光信号；有时荧光基团切割不完全给簇形成荧光背景，导致测序够长。 • 叠氮保护基团遇到巯基试剂(如二巯基丙醇)会发生断裂，并在原来的位置形成羟基，供下一个碱基合上。