404nm
f
0.11
0.29
0.36
CH2OCOCH3
维生素A
lex＝327nm， lem＝510nm
刚性平面结构
可降低化学键的旋转，增加共 轭健的共平面性，使荧光效率增加。
取代基
第一类：增加分子的电子共轭程度，
使荧光效率提高，荧光波长增长。如
-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-CN。
影响荧光强度的外部因素
1.温度 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，
荧光效率降低。
2.溶剂 溶剂的极性、氢键、配位键的形成、粘度都将 使化合物的荧光发生变化。极性、粘度增强，荧光 波长长移，强度增加。
3.酸度
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格 控制。不同荧光物质有其最适宜的pH值范围。
影响荧光强度的外部因素 4.荧光熄灭剂：重金属离子、卤素离子、 氧分子、硝基化合物、重氮化合物、 羰基和羧基化合物。 5.散射光：注意溶剂的拉曼散射的影响。 瑞利光（Reyleigh scattering light) 拉曼光(Raman scattering light) 波长比入射光更长的拉曼光 ，对荧光测定的 干扰更大。
定量分析方法
比例法
Fs F0 Cs Fx F0 C x Cs Fx F0 Cx Fs F0
联立方程法
荧光计
滤光片荧光计 滤光片-单色器荧光计 荧光分光光度计
氙灯 高压汞灯 染料激光 器
荧光
光 源
第一单色器 或滤光片
激发
记录仪
光电 倍增管
样品池
第二单色器 或滤光片
检测器
荧光法应用
1.无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
电子能级的多重态
电子能级的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1) M=1，单重态，用S表示（single state） M＝3，三重态，用T表示（triplet state）
↓
能 量
↑ ↑
禁阻跃迁
↑↓
单重基态
↑
激发单重态
激发三重态
内转换 S2
振动弛豫
(10-12 s)
体系间跨越
荧光分析新技术
激光荧光分析 时间分辨荧光分析 同步荧光分析 胶束增敏荧光分析
第二类：减弱分子的电子共轭程度，使荧 光减弱甚至熄灭。如：-COOH、-NO2、
-C＝O、-X、-NO、-SH。 第三类： 对电子共轭作用较小，对荧光的 影响不明显。如：-R、-SO3H、-NH3+。
荧光试剂
能与弱荧光物质或无机离子反应生
成强荧光物质的试剂。可扩大荧光分析
法的应用范围。
荧光胺：测定脂肪伯胺和芳香伯胺。 邻苯二甲醛（OPA）：测定伯胺、α-氨基酸。 丹酰氯:测定含有伯、仲胺基及酚基的生物碱 测定无机离子的荧光试剂
荧光法应用
2. 有机化合物的荧光分析 荧光分析法主要应用于有机物、生化 物质、药物的测定（200多种），包括： 有机化合物如：多环胺类、萘酚类、吲哚类、多环 芳烃、氨基酸、蛋白质等。 药物如：吗啡、喹啉类、异喹啉类、麦角碱、麻黄 碱等。 维生素如：维生素A、B1、B2、B6、B12、E、C、 叶酸 等。 甾体、抗生素、酶、辅酶 等。
S1
能 量 吸 收 T1 发 射 荧 光
(10-8 s)
外转换
发 射 磷 光
(>10-3 s)
S0
l1
l2
l 2
l3
ห้องสมุดไป่ตู้
激发态→基态 的能量传递途径
传递途径
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
磷光
体系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大。 荧光：10-7～10 -9 s, 第一激发单重态的最低振动能级→基态 磷光：10-4～10s， 第一激发三重态的最低振动能级→基态
浓度很低时，将括号项近似处理后：
F = 2.3 K’ I0 cl = Kc
注意：当cl >0.05时，F与C不成正比。
定量分析方法
校正曲线法 配制标准溶液系列，分别测定系列中各 溶液的荧光强度F，作校正曲线F-C图，根据 待测溶液的Fx值，在图中求出待测液的Cx。若 空白溶液的荧光强度不能校正到0，则须作 （F-F0）-C图。
2008年诺贝尔化学奖 －绿色荧光蛋白（GFP）
green fluorescence protein
科学家在线形虫体内植入绿色荧光蛋白质
GFP标记的微管
荧光与荧光分析法 （fluorescene and fluorometry) 荧光（fluorescene): 物质分子接受光子能量被激发后，从激 发态的最低能级返回基态时发射出的光。 荧光分析法（fluorometry)： 根据物质的荧光谱线位置及其强度进行 物质鉴定和含量测定的方法。选择性好，灵 敏度高，检测限达10-10g/ml,甚至10-12g/ml。
3.镜像关系
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称 关系。
n m 蒽的激发光谱（虚线）和荧光光谱（实线）
b2 b 1 b0
V=2 V=1 V=0
E2
E1
S1*
V=2 V=1 V=0
E2
E1 c0 c1 c2
S0
F
c0 b1 b0 c 1 b2 c2
解镜 释像 示关 意系
200
250
300
激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluorescence spectrum
1.荧光(磷光)的激发光谱： 固定测量波长 , 化合物发射的荧光 ( 磷光 ) 强度与照射光波长的关系曲线。 2.荧光(磷光)的发射光谱：固定激发光波长, 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波 长关系曲线。
350
400
450
500 n
荧光的产生与分子结构的关系
分子产生荧光必须具备的条件
1. 具有强的可见紫外吸收(长共轭分子）
2. 具有一定的荧光效率（f）（刚性平面分子）
发射荧光的光子数 f 吸收激发光的光子数
长共轭结构
苯
萘
蒽
lex 205nm
lem 278nm
286nm
321nm
356nm
F
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260
320
380
440
500
560
620 nm
室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
GFP的激发光谱与荧光光谱
激发光谱与发射光谱的关系 1.Stokes位移 荧光发射波长大于激发波长的现象。
内转换和振动弛豫是主要原因。
2.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能 量,产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最 低振动能级再跃迁回到基态，产生一个发射带。
自学思考题
6.测定某物质荧光时可在环己烷或四氯化碳 溶剂中进行。在365nm的激发光下，环己 烷与四氯化碳的拉曼散射光的波长分别为408nm和 375nm，若从测定荧光准确度方面考虑，选哪个溶 剂较好？ 7. 荧光定量分析法的定量关系式是什么？有何条件？ 8.请设计两种方法测定Al3+的含量。（一种化学分 析法，一种仪器分析法） 9.查阅文献举出一个荧光探针的应用例子（做ppt）
a
b
a：硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光 b：0.1mol/L硫酸溶液在不同波长下的拉曼散射光
溶液的荧光测定
入射光 I0
透射光 I
荧光 F
定量依据
荧光强度 F正比于吸收的光强度Ia 和荧光量子效率 ：
F = K’Ia
由朗伯-比耳定律： Ia = I0(1-10-cl )
F = K’ I0(1-10-cl ) = K’ I0(1-e-2.3cl )
第十一章
荧光分析法 （fluorometry)
2016/2/3
自学思考题与课堂讨论题 1.分子处于受激态后，回到基态的过程 有哪些方式？分子荧光是如何发生的？ 2.试从能级跃迁类型、光谱类型、灵敏度等 方面比较可见紫外光谱与分子荧光光谱的 区别和联系。 3.荧光发射光谱有哪些特征？ 4.何谓荧光效率？哪些分子结构的物质有较 高的荧光效率？ 5.影响荧光强度的外部因素有哪些？