• 镧系元素与通常的荧光物质相比较，镧系元素离子螯合 物荧光的衰变时间要长的多，为传统荧光的 103～106倍。
• 镧系离子与双功能螯合剂螯合后，可形成稳定的螯合物， 稳定性非常高，生产出的产品保质期可以长达 2 年。
三、时间分辨荧光分析技术简介
• TRFIA的基础试剂包括示踪剂、稀有元素双功能螯合剂、
在肿瘤、炎症发生和发展过程中起重要作用。因此,准确测 定细胞因子含量,对于了解它们病理生理作用是十分重要的。 1.2 测定补体:补体成分在多种自身免疫性疾病中起作用,临 床上常检测补体C3来评价免疫系统的功能。
2.在微生物方面的应用
由于TRFIA的方法灵敏度高,在ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ979年它的理论形成后,
研究重点放在试剂开发和利用上；
4.在激素方面的应用 用TRFIA检测人血清胰岛素含量;检测了hCG;血清中的
甲状腺激素;国外还用它检测动物的激素;
TRFIA分析血清、EDTA抗凝血浆和柠檬酸钠抗凝血浆 激素含量差别,发现只有在分析促甲状腺激素(TSH)、胰岛 素 (Ins)、TT3、雌二醇 (E2)、Testo (睾酮) 和Prog(孕 酮) 时柠檬酸钠抗凝血浆与血清有差别。
2.3 反应模式 常用的有双位点夹心法和固相抗体竞争法。
2.3.1 双位点夹心分析法使用针对被测物上不同抗原决定簇 的两个单克隆抗体,一个用Eu3 +标记,另一个包被固相载体, 经过免疫反应形成免疫复合物后,再将Eu3 +从复合物上完 全解离下来,在Eu3 +的增强液中与另一种螯合剂结合,在协 同剂的作用下,形成一个Eu3 +包裹于其内部的微胶囊(胶态 分子团) 。它在激发光作用下能发射出很强的荧光信号,其 强弱与待测抗原(或抗体) 含量相关。该法用于测定蛋白质 类大分子化合物。
1982年研制出用于测定风疹病毒抗体TRFIA的试剂；
1986年开创快速诊断流感的TRFIA方法；
2002年有关于同时检测弓形体IgM和IgA抗体TRFIA方法.
3.分子生物学的应用
标记的链霉亲合素2生物素探针,则会使核酸杂交整个过 程变得快速、简单。目前,稀土元素标记探针技术已用于检 测HIV、检测前列腺特异性抗原( PSA)的mRNA、腺病毒 DNA、肺炎链球菌DNA和HLA227等位基因,获得了满意 的结果。
抗原或抗体标记时,铕离子首先要作为标记物标记到抗原 或抗体上。标记时不同蛋白质的反应性依赖于蛋白表面的 游离氨基酸数目和蛋白质特异等电点。一般来说,游离氨基 酸数目越大,蛋白质的特异等电点越高,蛋白质易与螯合剂 反应,从而产生较高的标记率,但其标记比率与免疫反应不 成正比关系。镧系离子Eu3 +可用来标记核酸探针。
• 是近十年发展起来的非同位素免疫分析技术，是目前最灵 敏的微量分析技术,其灵敏度高达10-19g/ml，较放射免疫 分析（RIA）高出3个数量级。它用镧系元素标记抗原或 抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术 测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨， 可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏 度。
二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点
1.原理
TRFIA 是用镧系金属离子作为示踪物标记蛋白质、 多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,与其螯合剂、 增强液(有一部分不需要) 在待反应体系(如:抗原抗体免疫反 应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应 细胞的杀伤反应等) 发生反应后,用时间分辨荧光仪测定最后 产物中的荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测 反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。
1.3 增强溶液
免疫反应后所形成的复合物,在弱碱性缓冲液中经紫外 光激发所产生的荧光信号甚弱,这主要是因为水是稀土离子 经紫外光激发所产生荧光的淬灭剂。所以要加入一种增强 液。增强液一般由β-二酮体、三辛基氧化磷(TOPO)、 TritonX-100、醋酸和邻苯二甲酸氢钾(pH2.0 ~3.2)组 成。
示踪剂的使用 一般用Eu2O3制备成EuCl3,再经纯化和 常温真空抽干,然后干燥保存。
1.2 稀有元素双功能螯合剂
稀土元素作为金属离子,很难直接与抗原抗体结合,因此 在标记时需要有一种双功能基团的螯合物,它们分子内或带 氨基和羧基或带有异硫氰酸基和羧酸基,一端与稀土离子连 接,一端与抗原或抗体的自由氨基(组氨酸、酪氨酸) 连接。
AFB1的作用机制及对人体的危害
AFB1 干扰信息RNA 和DNA 的合成，是在翻译水平上 干扰了蛋白质生物合成，影响细胞代谢，因而它与人类及 动物的许多疾病存在着联系。
AFB1引起人的中毒主要是损害肝脏，发生肝炎, 肝区疼 痛，黄疸，肝硬化, 肝坏死乃至死亡，还可有心脏扩大、 痉挛、昏迷、胃肠道大出血等异常表现。长期食用被AFB1 污染的食物被认为是导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病的主要 原因，也能诱发肾癌、乳腺癌及卵巢癌等。
反应过程图
方法
1.抗AFB1 多克隆抗体的制备 先用弗氏完全佐剂1.2 mL 与1mg AFB1-BSA充分混
合，形成抗原乳化剂。在兔子背部多位点地进行皮下注射， 之后每隔1—2 周再用弗氏不完全佐剂与AFB1-BSA 充分 混匀后多次免疫。在免疫4次后，从兔子的耳缘静脉抽血， 分离血清，用免疫双扩散法进行抗体效价的鉴定。免疫6 次后，从兔子心脏采血，分离血清。
当前，最主要的真菌毒素主要有: 黄曲霉毒素、赭曲霉 毒素、伏马菌素、T-2 毒素、展青霉素、玉米赤霉烯酮和 脱氧雪腐镰刀菌烯醇等。
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2.真菌毒素的测定方法 • 目前，真菌毒素的测定方法有 TLC 法、HPLC 法等，
这些方法都不同程度地存在着样品前处理过程复杂、毒性 大、所需时间长等缺点。由于其他荧光物质、色素、结构 类似物对检测产生干扰，必须通过液-液萃取进行净化处 理，操作烦琐，有机试剂用量大，提取效率低，环境污染 严重。
2.物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最 低振动能级返回到基态时所发射出的光称为荧光 (fluorescence)。
3.根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和物 质含量测定的方法称为荧光分析法(fluorometry)。
• 5.时间分辨荧光分析法（Time resolved fluoroisnmuno assay,TRFIA）
时间分辨荧光分析法及其应用
目录
• 一、时间分辨荧光分析法的基本概念 • 二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点 • 三、时间分辨荧光分析技术简介 • 四、时间分辨荧光分析法的应用 • 五、时间分辨荧光免疫分析技术在真菌毒素检测
方面的应用 • 六、展望
一、基本概念：
1.有些物质受到光的照射时，除吸收某种波长的光之外还 会发射出波长相同或比吸收波长更长和的光，这种现象称 为光致发光。最常见的光致发光现象是荧光和磷光。
各国的标准
世界卫生组织推荐食品、饲料中AFB1的含量不能超过 15μg/kg，在婴儿食品中不能检出;欧盟国家的规定更加 的严格，规定了日常生活食用品中的 AFB1的含量不得超 过2μg/kg，总量不超过4μg/kg，最近已将部分食品中的 AFB1的含量限定在0.1μg/kg 以内。
我国对 AFB1的污染和控制也非常重视，在1982年颁布 了粮油和发酵食品中的AFB1允许量标准。规定大米、食用 油中AFB1的含量不超过10μg/kg，其他粮食、豆类及发 酵食品的含量不能超过5μg/kg。
分析缓冲液、增强溶液。 • 基本技术包括包被技术、标记技术、反应模式。
1.基础试剂：
1.1示踪剂的选择 所使用的稀土元素主要位于元素周期表中的 ⅢB族,包
括钪(scandium,SC)、钇(yttrium , Y)和镧系元素。到 目前为止,只有铕(europium , Eu)、铽(terbium ,Tb)、 钐(samarium ,Sm)、钕 (neodymium ,Nd)、镝 (dysprosium ,Dy)等5种被用作TRFIA示踪剂,尤以 Eu3 +常用。
2.3.2 固相抗体竞争法是对一些小分子半抗原化合物,因分 子质量小,不能直接进行固相包被,如多肽、甲状腺激素类 和一些药物等,都必须经过化学耦联剂与载体蛋白质进行共 价键结合,然后可包被聚苯乙烯微量滴定条孔壁,制成固相 抗原.
四、时间分辨荧光分析法的应用
1.在免疫学的应用 1.1 测定细胞因子:细胞因子不仅仅参与免疫应答反应,而且
2.基本技术：
2.1 包被技术
TRFIA包被技术,是保持其灵敏度重要因素,因此在包被 抗体之前,往往要对抗体进行纯化,以提高抗体的包被量和 均一性。国内外最早的使用的包被的缓冲体系为pH9.6的 碳酸盐缓冲液,90年代后改为柠檬酸缓冲液,pH为4.5 ,效 果明显优于碳酸盐缓冲系统。
2.2 标记技术
现在TRFIA已经取代RIA、EIA等方法,检测项目涉及甲 状腺激素、性腺激素、下丘脑分泌的激素、胰岛素、胃泌 素等各个方面。
五、时间分辨荧光分析法在真菌毒素检测方 面的应用
1.真菌霉素概述
真菌毒素是由产毒真菌( 主要为曲霉属、青霉属及镰孢 属) 在适宜的环境条件下产生的具有很强毒性的二级代谢 产物，它主要对食品、农作物及饲料等污染很严重。
• 仪器 紫外吸收测定仪DU-650 ，酶标测定仪3550-UV 全自动TRFIA 检测仪AutoDELFIA 1235
AFB1-TRFIA 检测方法的建立：
采用时间分辨荧光技术建立了高灵敏的黄曲霉毒素 B1( AFB1) 间接竞争免疫分析法( AFB1-TRFIA) 。以 AFB1-BSA 为免疫原免疫新西兰大白兔制备抗AFB1抗体； AFB1 与辣根过氧化酶的联结物（AFB1-HRP）包被96 孔 板为固相抗原，与游离AFB1 共同竞争有限的抗AFB1 抗 体；用稀土离子Eu3+标记的羊抗兔抗体进行示踪。
材料与仪器
• 材料 黄曲霉毒素B1 、 二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、 偶联牛血清白蛋白的黄曲霉毒素B1（AFB1-BSA）、 牛血清白蛋白（BSA）、辣根过氧化酶（HRP）、 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂、96 孔微孔板、 亲和层析纯化的羊抗兔IgG 、Sephadex-G50 、 Eu3+标记盒（1244-302）、PD-10 等